Delitto perfetto - Delitto perfetto

Delitto perfetto (İtalyan:[deˈlitto perˈfɛtto]) genetik bir tekniktir in vivo Bölgeye yönelik mutagenez mayada. Bu isim, İtalyanca "kusursuz cinayet" için kullanılan bir terimdir ve tekniğin, herhangi bir yabancı DNA bırakmadan istenen genetik değişiklikleri yaratma yeteneğini ifade eder. genetik şifre.

Arka fon

Bu teknik, bir grup tarafından geliştirilmiştir. Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS) Michael A. Resnick, Francesca Storici (şu anda Georgia Teknoloji Enstitüsü'nde) ve L. Kevin Lewis'den (şu anda Southwest Texas Eyalet Üniversitesi'nde) oluşmaktadır. Yöntem sentetik kullanır oligonükleotidler hücresel işlemle birlikte homolog rekombinasyon. Sonuç olarak, oldukça verimli homolog rekombinasyona sahip olan mayanın genetik manipülasyonu için çok uygundur. delitto perfetto yaklaşım, tek ve çok noktalı mutasyonlar, gen kesmeleri veya eklemeleri ve tüm gen delesyonlarını (temel genler dahil) üretmek için kullanılmıştır.

Avantajlar

Bu tekniğin birincil avantajı, mutagenez sürecinden sonra herhangi bir yabancı DNA'yı genomdan elimine edebilmesidir. Bu, seçilebilir belirteçler veya öngörülemeyen etkilere neden olabilen genomda kalanı hedeflemek için kullanılan eksojen diziler.

delitto perfetto teknik ayrıca diğer yöntemlere kıyasla daha basittir. in vivo Bölgeye yönelik mutagenez. Diğer yöntemler birden fazla klonlama adımı ve kapsamlı DNA dizilimi genellikle karmaşık ve verimsiz bir süreç olan mutagenezi doğrulamak için.[1][2][3]

Bu yaklaşımda büyük bir esneklik vardır, çünkü CORE kaseti yerleştirildikten sonra (ayrıntılar için Yönteme Genel Bakış'a bakınız), ilgilenilen gendeki çoklu mutasyonlar kolay ve hızlı bir şekilde yapılabilir.

Bu yöntem, yosun gibi homolog rekombinasyonun verimli olduğu diğer organizmalara uygulanabilir. Physcomitrella patens, DT40 tavuk hücreleri veya E. coli. Ek olarak, insan genleri incelenebilir ve benzer şekilde genetik olarak manipüle edilmiş mayada kullanarak maya yapay kromozomları (YAC'ler).

Dezavantajları

Beri delitto perfetto teknik homolog rekombinasyona dayanmaktadır, bu işlem tekniğin çalışması için hücrelerde işlevsel olmalıdır. İçinde Saccharomyces cerevisiae, RAD52 gen homolog rekombinasyon için gereklidir ve bu nedenle delitto perfetto yöntem.

Yöntem, yalnızca seçilebilir işaretleyicilerin gerekli olmadığı uygulamalar için kullanışlıdır. Örneğin, mutasyona uğratılmış maya suşları, tetrad analizi gibi daha fazla genetik analiz için kullanılamaz. İşaretçilerin ayrı bir işlemle uygun lokusa eklenmesi gerekecektir.

Teknik sakıncalar

  • Oligonükleotitlerin maliyeti
  • Mutagenez, eklenen kaseti çevreleyen genom bölgesi ile sınırlıdır
  • Sınırlı sayıda muhabir genleri (mevcut CORE kasetleriyle sınırlıdır)
  • Belirli uygulamalar için düşük verimlilik (ör. Temel genlerin silinmesi)

Yönteme genel bakış

Delitto Perfetto iki aşamalı bir yöntemdir in vivo mutagenez. İlk adımda, CORE kaseti ilgi alanına homolog rekombinasyon yoluyla yerleştirilir. Daha sonra, CORE kaseti ilgili mutasyonu içeren DNA ile değiştirilir.

Şekil 1. CORE Kasetler Delitto Perfetto

CORE kasetleri

CORE kasetinde hem bir COseçilemeyen işaretçi ve YENİDENporter geni. Haberci gen, işlemin ilk adımı sırasında CORE kasetini alan maya hücrelerinin seçilmesine izin verir. Karşı seçilebilir markör, işlemin ikinci adımı sırasında mutasyona uğramış oligonükleotidin entegrasyonu ile CORE kasetini kaybeden maya hücrelerinin seçilmesine izin verir.

Çeşitli muhabir genleri, karşı seçilebilir yapıcılar ve ek özellikler içeren, aralarından seçim yapabileceğiniz çeşitli CORE kasetleri vardır.[4]

Muhabir genleri

  • kanMX4 - içeren medyada büyümeye izin verir Genetisin
  • hyg - içeren medyada büyümeye izin verir Higromisin B.

Karşı seçilebilir işaretçiler

  • KlURA3 - 5-floroorotik asit içeren ortamlarda büyümeyi önler.
  • GAL1 / 10-p53 - içeren ortamlarda büyümeyi önler galaktoz. Toksik bir mutantı kodlar s53 altında GAL1 organizatör.[5]

Ek özellikler

  • GAL1-BEN-SceI - Diploid hücrelerde CORE kaset içeren kromozomu hedeflemenin etkinliğini artırır. İçerir kısıtlama endonükleaz SceI altında GAL1 promoter ve SceI hedef dizisi.[6][7]
şekil 2. Genel BakışDelitto Perfetto Gen Silme için

Teknik iş akışı

İlk önce CORE kaseti şu şekilde güçlendirilir: PCR ekleneceği kromozomal bölgeye homoloji bölgeleri içeren primerler ile. CORE kaseti homolog rekombinasyon yoluyla entegre edilmiştir. CORE kasetini içeren hücreler, raportör geni kullanmak için seçilebilir ve karşı seçilebilir markör kullanılarak ayrıca doğrulanabilir. CORE kasetinin doğru kromozomal lokasyona entegrasyonu, 500-1500 bp fragmanlar oluşturmak üzere tasarlanmış CORE içinde ve entegrasyon boyutunun aşağı akışında, entegrasyon sitesinin yukarı akışını tavlayan primerler kullanılarak PCR aracılığıyla doğrulanabilir.[4]

CORE içeren maya hücreleri, homolog rekombinasyon sırasında CORE kasetinin kaybına yol açacak şekilde istenen mutasyonu içeren oligonükleotidler ile dönüştürülür. Transformantlar, karşı seçilebilir markör kullanılarak seçilir ve raportör gen kullanılarak ayrıca taranabilir. Sıralama, ek mutasyonlar olmadan doğru mutasyonun üretildiğinden emin olmak için kullanılır. Alternatif olarak, eğer mutasyon bir kısıtlama bölgesinin oluşumuna veya kaybına yol açar, PCR ve ardından kısıtlama sindirimi istenen mutasyonun entegre edildiğini doğrulamak için kullanılabilir.[4]

Çift sarmallı kırılma (DSB) aracılı delitto perfetto

CORE kasetine oligonükleotid hedeflemesini artırmak için, aşağıdakileri içeren CORE kasetleri GAL1-BEN-SceBen özelliği kullanılabilir. Bu özellik, son derece benzersiz bir 18 nükleotid dizisini tanıyan bir endonükleaz olan SceI'nin ekspresyonuna izin verir. S. cerevisiae genetik şifre. SceI endonükleaz, SceI sitesinde bir DSB oluşturabilir ve bu da DNA onarımı makine.[8] Bu, hedeflenen homolog rekombinasyonun sıklığını, DSB'nin üretilmediği zamana kıyasla 4.000 kat arttırır.[6]

Oligonükleotid tasarımı için genel hususlar

80–100 bp oligonükleotidler, tek moleküller veya tamamen örtüşen veya kısmen örtüşen oligonükleotit çiftleri olarak üretilebilir. Önerilen oligonükleotid tipi, mutasyon tipine ve bir mutasyonun arzu edildiği CORE kaset entegrasyon bölgesinden mesafeye bağlıdır.

Daha uzun oligonükleotidler, artan dönüşüm verimliliğine yol açar. Tamamen tamamlayıcı oligonükleotit çiftleri, tek oligonükleotitlere kıyasla verimlilikte 5-10 kat artışa neden olur ve tüm uygulamalar için önerilir.[4][9] Ancak, CORE kasetinden sadece 20-40 bazlık küçük bir mutagenez penceresi sağlarlar. Mutagenez penceresini arttırmak için, 20 bp'lik bir örtüşmeye sahip oligonükleotid çiftleri kullanılabilir ve bunlar, CORE entegrasyon sahasının 100 bp'ye kadar yukarı ve aşağı akışının hedeflenmesine izin verir. Ancak, yaklaşık 6 kat daha az verimli dönüşürler. Verimliliği artırmak için kısmen örtüşen oligonükleotidler uzatılabilir laboratuvar ortamında.[9]

Gen silinmeleri için

Hemen üst akış dizisini ve ardından nakavt edilecek bölgenin alt akış yönündeki diziyi içeren oligonükleotidler tasarlanır. Gen delesyonları için, tam olarak örtüşen 80–100 bp oligonükleotit çiftleri, dönüşüm verimliliğinde tek oligonükleotitlere göre 5-10 kat artışa yol açar.[4]

Nokta mutasyonları için

CORE kasetinden 20 ila 40 bp mutasyonlar için, 80–100 bp tamamen örtüşen oligonükleotidler önerilir. CORE kasetinden 40 bp'den fazla mutasyonlar için kısmen örtüşen oligonükleotidler kullanılmalıdır. Dönüşüm etkinliklerini arttırmak için kısmen örtüşen oligonükleotitlerin uzatılması tavsiye edilir. laboratuvar ortamında.[4][6][9]

Temel genler için

Esansiyel genlerin mutantlarını oluşturmak için, CORE kaseti ilgilenilen genin aşağı akışına yerleştirilebilir, ancak bu, genin mutasyon için mevcut bölgelerini sınırlar. Alternatif olarak diploid hücreler de kullanılabilir. Bununla birlikte, bir diploid kullanılması, oligonükleotitlerin yeniden birleştirilmesi için iki uygun kromozomal konumun varlığından dolayı oligonükleotit hedeflemesinin verimini azaltır. Bu dezavantajı gidermek için, DSB aracılı delitto perfetto yöntemi kullanılabilir. Bu, hedeflenen homolog rekombinasyonun sıklığını, DSB oluşturulmadığı zamana kıyasla 700 kat arttırır. Dahası, mevcut diğer yöntemlerden 2–5 kat daha etkilidir.[6][9]

Arka plan mutasyon oranları

Hiçbir çift sarmallı kırılma meydana gelmediğinde, bir hedefleme oligonükleotidinin yokluğunda CORE kasetini kaybeden hücre sayısının 10'da bir transformanttan daha az olduğu bildirilmiştir.7 canlı hücreler. Buna karşılık, bu sayı her 107 çift ​​sarmallı bir kırılma meydana geldiğinde canlı hücreler. Bir diploidde, hedeflenen dönüşüm olaylarını toplam transformantların sadece% 4'üne düşüren homolog kromozom ile homolog rekombinasyon nedeniyle artan arka plan mutasyon oranları meydana gelir.[6]

Referanslar

  1. ^ Erdeniz N., Mortensen UH., Rothstein R. (1997) Klonlama içermeyen PCR tabanlı alel değiştirme yöntemleri. Genome Res. 7: 1174-83.
  2. ^ Langle-Rouault F., Jacobs E. (1995) Geri dönüştürülebilir seçilebilir bir işaretleyici kullanarak maya genomunda hassas değişiklikler yapmak için bir yöntem. Nucleic Acids Res. 23: 3079-81.
  3. ^ Scherer S., Davis RW. (1979) Kromozom segmentlerinin değiştirilmiş DNA dizileri ile değiştirilmesi laboratuvar ortamında. Proc Natl Acad Sci. 76: 4951-5.
  4. ^ a b c d e f Storici F., Resnick MA. (2006) Delitto perfetto yaklaşımı in vivo maya içindeki sentetik oligonükleotidlerle bölgeye yönelik mutagenez ve kromozom yeniden düzenlemeleri. Methods Enzymol. 409: 329-45.
  5. ^ Inga A., Resnick MA. (2001) Maya için toksik olan yeni insan p53 mutasyonları, spesifik promoterlerin ve reaktif tümör p53 mutantlarının transaktivasyonunu artırabilir. Onkogen. 14; 20 (27): 3573-9
  6. ^ a b c d e Storici F., Durham CL., Gordenin DA., Resnick MA. (2003) Kromozomal bölgeye özgü çift sarmallı kırılmalar, mayadaki oligonükleotidler tarafından onarım için verimli bir şekilde hedeflenir. Proc Natl Acad Sci. 9; 100 (25): 14994-9
  7. ^ Plessis A., Perrin A., Haber JE., Dujon B. (1992) Bölgeye özgü rekombinasyon, maya çekirdeğinde eksprese edilen bir mitokondriyal grup I intron kodlu endonükleaz olan I-SceI tarafından belirlenir. Genetik. 130 (3): 451-60
  8. ^ Storici F., Resnick MA. (2003) Delitto perfetto, oligonükleotidlerle mayada mutagenezi hedefledi. Genet Müh. 25: 189-207
  9. ^ a b c d Storici F., Lewis LK., Resnick MA. (2001) Oligonükleotidler kullanılarak in vivo bölgeye yönelik mutagenez. Nat Biotechnol. 19 (8): 773-6