Floxing - Floxing

Bu şekil, Floxing'in gen ifadesinin uzamsal ve zamansal kontrolü için bilimsel araştırmalarda nasıl kullanıldığını göstermektedir.

Genetikte, floxing bir DNA dizisi (daha sonra olduğu söylenir floxed) ikisi arasında lox P Siteler. Terimler, "LoxP tarafından kuşatılmış / yandan kuşatılmış" ifadesi üzerine inşa edilmiştir. Rekombinasyon LoxP siteleri arasında şunlar katalizlenir: Cre rekombinaz. Bir genin floxing işlemi, adı verilen bir işlemle silinmesine (nakavt edilmesine), yer değiştirmesine veya ters çevrilmesine izin verir. Cre-Lox rekombinasyonu. [1] Genlerin yüzdürülmesi, araştırmacıların gen ifadesinin mekansal ve zamansal değişimine sahip olmasına izin verdiği için bilimsel model sistemlerinin geliştirilmesinde çok önemlidir.[2] Dahası, fareler gibi hayvanlar, insan hastalığını incelemek için model olarak kullanılabilir. Bu nedenle, Cre-lox sistemi, insan hastalıklarını ve ilaç gelişimini incelemek için farelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için kullanılabilir.[3] Örneğin, Cre-lox sistemini kullanarak araştırmacılar çalışabilir onkojenler ve Tümör süpresörü genler ve bunların gelişimi ve ilerlemesindeki rolleri kanser fare modellerinde.[4]

Araştırmada kullanır

Bir geni floxing yapmak, onun silinmesine izin verir (knock out),[5][6] yeri değiştirilmiş veya yerleştirilmiş[7] (Cre-Lox rekombinasyonundaki çeşitli mekanizmalar yoluyla).

Gen ekspresyonunun uzamsal ve zamansal değişimine izin verdiği için, genlerin flekslenmesi bilimsel model sistemlerinin geliştirilmesinde esastır. Layman'ın terimleriyle, gen belirli bir dokuda nakavt edilebilir (inaktive edilebilir). in vivo, bilim adamı tarafından seçilen herhangi bir zamanda. Bilim adamı daha sonra nakavt edilmiş genin etkilerini değerlendirebilir ve genin normal işlevini belirleyebilir.[8]. Bu, gebe kalmadan başlayarak genin bulunmamasından farklıdır, bu nedenle organizmanın gelişimi için gerekli olan genlerin inaktivasyonu veya kaybı, hücrelerin normal işlevine müdahale edebilir ve canlı yavruların üretimini önleyebilir.[9]

Silme mekanizması

Cre-lox sistemini kullanan genetikte bir model deneyi: floxed farelerde bulunan erken durdurma dizisi, yalnızca fareler bir araya getirildiğinde Cre rekombinaz ifade eden hücrelerden çıkarılır.

Silme olayları, genlerin bölümlerini veya hatta tüm genleri hassas bir şekilde düzenleyerek gen düzenleme deneyleri yapmak için yararlıdır. Silme, ilgilenilen segmentin aynı yöne bakan loxP siteleriyle yüzdürülmesini gerektirir. Cre rekombinaz, tek yönlü loxP sitelerini tespit edecek ve DNA'nın floxed segmentini çıkaracaktır.[10] Başarıyla düzenlenen klonlar, aynı Cre-loxP sistemi kullanılarak çıkarılabilen bir seçim işaretçisi kullanılarak seçilebilir.[10] Aynı mekanizma oluşturmak için kullanılabilir koşullu aleller tanıtarak FRT / Flp aynı mekanizmayı farklı bir enzimle gerçekleştiren site.

Ters çevirme mekanizması

Tersine çevirme olayları, genetik materyal miktarını korumak için faydalıdır. Tersine çevrilmiş genler genellikle anormal fenotipler yani ters çevrilmiş genler genellikle yaşayabilir.[11] Eklemeyle sonuçlanan Cre-loxP rekombinasyonu, loxP bölgelerinin birbirine doğru yönlendirilmiş loxP bölgeleri ile ilgilenilen geni yüzdürmesini gerektirir. Cre rekombinasyonuna tabi tutularak, loxP sitelerinin yüzdüğü bölge tersine çevrilecek,[12] bu süreç kalıcı değildir ve tersine çevrilebilir.[13]  

Translokasyon mekanizması

Translokasyon olayları, loxP siteleri tek yönlü bir yönde iki farklı DNA molekülü üzerinde genleri akıttığında meydana gelir. Cre rekombinaz daha sonra iki DNA molekülü arasında bir translokasyon oluşturmak için kullanılır ve genetik materyali bir DNA molekülünden diğerine değiştirerek her iki floklanmış genin eşzamanlı bir translokasyonunu oluşturur.[14][15]

Araştırmada yaygın uygulamalar

Kardiyomiyositler (kalp kası dokusu), kardiyomiyositlere oldukça spesifik olan ve araştırmacılar tarafından yüksek verimli rekombinasyonlar gerçekleştirmek için kullanılabilen bir tür Cre rekombinaz ifade ettiği gösterilmiştir. Bu, ifadesi tarafından yönlendirilen bir Cre türü kullanılarak elde edilir. -miyosin ağır zincir promotörü (-MyHC). Bu rekombinasyonlar, genleri yalnızca kalp dokusuna özgü bir şekilde bozabilir. in vivo ve çoğunlukla kontrol olarak kullanılmak üzere kalbin koşullu nakavtlarının yaratılmasına izin verir.[16]

Örneğin, Cre rekombinaz ile -MyHC promoter, floxed genin sadece kalpte inaktive olmasına neden olur. Ayrıca, bu nakavtlar indüklenebilir olabilir. Birkaç fare çalışmasında, tamoksifen indüklemek için kullanılır Cre rekombinaz.[17][18] Bu durumda, Cre rekombinaz farenin bir kısmıyla birleştirilir östrojen reseptörü (ER) içinde bir mutasyon içeren ligand bağlanma alanı (LBD). Mutasyon, reseptörü etkisiz hale getirir, bu da ısı şoku proteini 70 ve 90 gibi şaperon proteinleriyle etkileşimleri nedeniyle yanlış lokalizasyona yol açar (Hsp70 ve Hsp90 ). Tamoksifen, Cre-ER'ye bağlanır ve şaperonlarla etkileşimlerini bozar, bu da Cre-ER füzyon proteininin çekirdeğe girmesine ve flekslenmiş gen üzerinde rekombinasyon gerçekleştirmesine izin verir.[19][20] Bunlara ek olarak, Cre rekombinaz belirli ısı şok elemanlarının (HSE'ler) kontrolü altındayken ısı ile indüklenebilir.[21][22]

Referanslar

  1. ^ Nagy A (Şubat 2000). "Cre rekombinaz: genom uyarlaması için evrensel reaktif". Yaratılış. 26 (2): 99–109. doi:10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B. PMID  10686599. S2CID  2916710.
  2. ^ Hayashi S, McMahon AP (Nisan 2002). "Tamoksifen ile indüklenebilir bir Cre formu ile çeşitli dokularda verimli rekombinasyon: farede geçici olarak düzenlenen gen aktivasyonu / inaktivasyonu için bir araç". Gelişimsel Biyoloji. 244 (2): 305–18. doi:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  3. ^ Fare genetiği: yöntemler ve protokoller. Singh, Shree Ram, Coppola, Vincenzo. New York, NY. ISBN  9781493912155. OCLC  885338722.CS1 Maint: diğerleri (bağlantı)
  4. ^ Yeşil JE, Ried T (2012). Kanser Araştırmaları için Genetiği Değiştirilmiş Fareler. doi:10.1007/978-0-387-69805-2. ISBN  978-0-387-69803-8.
  5. ^ Friedel RH, Wurst W, Wefers B, Kühn R (2011). "Koşullu nakavt fareler oluşturma". Transgenik Fare Yöntemleri ve Protokolleri. Moleküler Biyolojide Yöntemler. 693. s. 205–31. doi:10.1007/978-1-60761-974-1_12. ISBN  978-1-60761-973-4. PMID  21080282.
  6. ^ Sakamoto K, Gurumurthy CB, Wagner K (2014), Singh SR, Coppola V (ed.), "Koşullu Nakavt Farelerin Üretimi", Fare Genetiği, Springer New York, 1194, s. 21–35, doi:10.1007/978-1-4939-1215-5_2, ISBN  9781493912148, PMID  25064096
  7. ^ Imuta Y, Kiyonari H, Jang CW, Behringer RR, Sasaki H (Mart 2013). "Foxa2 ve T lokuslarından gelen notokordda nükleer gelişmiş yeşil floresan protein ve tamoksifen ile indüklenebilir Cre rekombinaz eksprese eden knock-in farelerin üretimi". Yaratılış. 51 (3): 210–8. doi:10.1002 / dvg.22376. PMC  3632256. PMID  23359409.
  8. ^ Hall B, Limaye A, Kulkarni AB (Eylül 2009). "Genel Bakış: Gen nakavt farelerin üretimi". Hücre Biyolojisinde Güncel Protokoller. Bölüm 19: Birim 19.12 19.12.1–17. doi:10.1002 / 0471143030.cb1912s44. PMC  2782548. PMID  19731224.
  9. ^ Rodrigues Ortak Girişimi, Shakhnovich EI (2019-08-01). "Esansiyel bir E. coli geninin mutasyonel inaktivasyonuna adaptasyon, erişilebilir bir suboptimal uygunluk zirvesine yaklaşır". bioRxiv: 552240. doi:10.1101/552240.
  10. ^ a b Schwenk F, Baron U, Rajewsky K (Aralık 1995). "Germ hücrelerinde delesyon dahil loxP-yanlı gen segmentlerinin her yerde silinmesi için bir cre-transgenik fare suşu". Nükleik Asit Araştırması. 23 (24): 5080–1. doi:10.1093 / nar / 23.24.5080. PMC  307516. PMID  8559668.
  11. ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). "Ters Çevirmeler". Genetik Analize Giriş. 7. Baskı.
  12. ^ Xu J, Zhu Y (Ağustos 2018). "Bir plazmidde çift floxlu ters çevrilmiş açık okuma çerçevesini geri çevirmek için hızlı bir in vitro yöntem". BMC Biyoteknoloji. 18 (1): 52. doi:10.1186 / s12896-018-0462-x. PMC  6119287. PMID  30170595.
  13. ^ Oberdoerffer P, Otipoby KL, Maruyama M, Rajewsky K (Kasım 2003). "Mutant loxP çifti lox66 / lox71 kullanan farelerde Tek Yönlü Cre aracılı genetik inversiyon". Nükleik Asit Araştırması. 31 (22): 140e – 140. doi:10.1093 / nar / gng140. PMC  275577. PMID  14602933.
  14. ^ Xu J, Zhu Y (Ağustos 2018). "Bir plazmidde çift floxlu ters çevrilmiş açık okuma çerçevesini geri çevirmek için hızlı bir in vitro yöntem". BMC Biyoteknoloji. 18 (1): 52. doi:10.1186 / s12896-018-0462-x. PMC  6119287. PMID  30170595.
  15. ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). "Translokasyonlar". Genetik Analize Giriş (7. baskı).
  16. ^ Pugach EK, Richmond PA, Azofeifa JG, Dowell RD, Leinwand LA (Eylül 2015). "Α-miyozin ağır zincir promotörü tarafından yönlendirilen uzun süreli Cre ifadesi, kardiyotoksik olabilir". Moleküler ve Hücresel Kardiyoloji Dergisi. 86: 54–61. doi:10.1016 / j.yjmcc.2015.06.019. PMC  4558343. PMID  26141530.
  17. ^ Hayashi S, McMahon AP (Nisan 2002). "Tamoksifen ile indüklenebilir bir Cre formu ile çeşitli dokularda verimli rekombinasyon: farede geçici olarak düzenlenen gen aktivasyonu / inaktivasyonu için bir araç". Gelişimsel Biyoloji. 244 (2): 305–18. doi:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  18. ^ Hayashi S, McMahon AP (Nisan 2002). "Tamoksifen ile indüklenebilir bir Cre formu ile çeşitli dokularda verimli rekombinasyon: farede geçici olarak düzenlenen gen aktivasyonu / inaktivasyonu için bir araç". Gelişimsel Biyoloji. 244 (2): 305–18. doi:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  19. ^ Danielian PS, Muccino D, Rowitch DH, Michael SK, McMahon AP (Aralık 1998). "Tamoksifen ile indüklenebilir bir Cre rekombinaz formu ile utero fare embriyolarında gen aktivitesinin modifikasyonu". Güncel Biyoloji. 8 (24): 1323–6. doi:10.1016 / s0960-9822 (07) 00562-3. PMID  9843687.
  20. ^ Transgenez teknikleri: ilkeler ve protokoller. Clarke, Alan R. (2. baskı). Totowa, NJ: Humana Press. 2002. ISBN  9781592591787. OCLC  50175106.CS1 Maint: diğerleri (bağlantı)
  21. ^ Yengeç ve zebra balığı: mekanizmalar, teknikler ve modeller. Langenau, David M. İsviçre. ISBN  9783319306544. OCLC  949668674.CS1 Maint: diğerleri (bağlantı)
  22. ^ Kobayashi K, Kamei Y, Kinoshita M, Czerny T, Tanaka M (Ocak 2013). "Medaka'da ısıyla indüklenebilir CRE / LOXP gen indüksiyon sistemi". Yaratılış. 51 (1): 59–67. doi:10.1002 / dvg.22348. PMID  23019184.