Hibridizasyon deneyi - Hybridization assay

Bir hibridizasyon deneyi ölçülebilir herhangi bir hibridizasyon biçimini içerir yani iki tamamlayıcı telin kantitatif tavlanması nükleik asitler, olarak bilinir nükleik asit hibridizasyonu.[1]

Genel Bakış

Biyokimya ve ilaç geliştirme bağlamında, bir hibridizasyon deneyi bir tür Ligand Bağlanma Deneyi (LBA) biyolojik matrislerdeki nükleik asitleri ölçmek için kullanılır. Hibridizasyon deneyleri çözelti halinde veya 96 oyuklu plakalar veya etiketli boncuklar gibi katı bir destek üzerinde olabilir.

Hibridizasyon tahlilleri, ilgili verileri tanımlamak için etiketlenmiş nükleik asit problarını içerir. DNA veya RNA etiketlenmemiş karmaşık bir karışım içindeki moleküller (yani önemli ölçüde yüksek dizi benzerliği ile) nükleik asit moleküller. Antisens tedavisi, siRNA, ve diğeri oligonükleotid ve nükleik asit bazlı biyoterapötikler hibridizasyon deneyleri ile ölçülebilir.

Hibridizasyon yöntemlerinin sinyalizasyonu, sentez içinde modifiye edilmiş oligonükleotid probları kullanılarak gerçekleştirilebilir. haptenler ve küçük molekül ligandlar yakalama ve saptama antikorlarına homolog hareket eden. Geleneksel olduğu gibi ELISA yaban turpu peroksidazına (HRP) konjugatlar veya alkalin fosfataz (AP) ikincil antikorlar olarak kullanılabilir.

Sandviç hibridizasyon deneyi

Sandviç hibridizasyon deneyi

Sandviç hibridizasyonunda ELISA deney formatı, ELISA'daki antijen ligandı ve antikorlar, bir nükleik asit analiti, tamamlayıcı oligonükleotit yakalama ve saptama probları ile değiştirilir.[2]

Genel olarak, nükleik asit hibridizasyonu durumunda, tek değerlikli tuz konsantrasyonu ve sıcaklığı, tuz konsantrasyonunun genellikle bağlama ve yıkama aşamaları (yani PBS veya TBS) için sabitleneceği geleneksel ELISA'nın tersine, hibridizasyon ve yıkama sertliği için kontrol edilir. Bu nedenle, hibridizasyon deneylerindeki optimal tuz konsantrasyonu, analitin uzunluğuna ve baz bileşimine, yakalama ve saptama problarına bağlı olarak değişir.

Rekabetçi hibridizasyon deneyi

Rekabetçi hibridizasyon deneyi[3] geleneksele benzer rekabetçi immunoassay. Diğer hibridizasyon tahlilleri gibi, yakalama probunun analit ile izleyici - analit için etiketli bir oligonükleotid analoğu - arasında rekabet ettiği tamamlayıcılığa dayanır.

Hibridizasyon-ligasyon deneyi

Hibridizasyon-ligasyon deneyinde[4][5] bir şablon prob, katı desteğe immobilizasyon için sandviç testinde yakalama probunun yerini alır. Şablon prob, oligonükleotid analitine tamamen tamamlayıcıdır ve aşağıdakiler için bir substrat olarak hizmet etmesi amaçlanmıştır. T4 DNA ligaz aracılı ligasyon. Şablon prob ek olarak bir ligasyon probuna tamamlayıcı ek bir gerdirmeye sahiptir, böylece ligasyon probu 3'-uç analitin. Jenerik olmasına rağmen, ligasyon probu, örneğin aşağı akım sinyali için digoksigenin ile etiketlendiğinden bir tespit probuna benzer. Sıkı, az / tuzsuz yıkama, bağlanmamış ürünleri çıkaracaktır.

Analitin ligasyon probuna ligasyonu, yöntemi analitin 3'-ucuna özgü kılar, T4 DNA ligaz ile ligasyon, bir çıkıntı döngüsüne göre çok daha az etkilidir ve bu, 3 'metaboliti N-1 versiyonu için meydana gelir. örneğin analit. 3'-ucunda ligasyon için hibridizasyon-ligasyon deneyinin özgüllüğü özellikle önemlidir çünkü kandaki baskın nükleazlar 3 'ila 5' arasındadır. eksonükleazlar.

Yöntemin bir sınırlaması, örneğin hedefleme parçaları 3'-uca eklendiğinde mevcut olmayabilen serbest bir 3'-uçlu hidroksili gerektirmesidir. Ayrıca, oligonükleotid ilaçları ile daha egzotik nükleik asit kimyaları, vaka bazında belirlenmesi gereken ligaz aktivitesini etkileyebilir.

Çift ligasyon hibridizasyon deneyi

Çift Ligasyon Hibridizasyon Deneyi

Çift ligasyon hibridizasyon deneyi (DLA)[6] hibridizasyon-ligasyon tahlilinin özgüllüğünü ana bileşik için özel bir yönteme genişletir. Hibridizasyon-ligasyon tahlilinin oligonculeotid analitinin 3'-ucu için sağlamlığına, duyarlılığına ve ilave özgüllüğüne rağmen, hibridizasyon-ligasyon deneyi, analitin 5 'ucu için spesifik değildir.

DLA'nın, hem sağlam 5 'hem de 3' uçları ile yalnızca tam uzunluktaki ana oligonükleotid bileşiğini ölçmesi amaçlanmıştır. DLA probları, analitin 5 've 3' uçlarına aşağıdaki eklem etkisiyle bağlanır. T4 DNA ligaz ve T4 polinükleotid kinaz. Kinaz, analitin 5'-ucunu fosforile eder ve ligaz, yakalama probunu analit ile algılama probuna birleştirir. DLA'daki yakalama ve saptama probları bu nedenle ligasyon probları olarak adlandırılabilir. Hibridizasyon-ligasyon tahliline gelince, DLA ana bileşiğe özgüdür çünkü bir tümsek ilmeği üzerindeki ligasyonun etkinliği düşüktür ve bu nedenle DLA, hem sağlam 5 'hem de 3'-uçlu tam uzunluktaki analiti tespit eder. DLA ayrıca biyolojik matrislerdeki bireysel metabolitlerin belirlenmesi için de kullanılabilir.

Hibridizasyon-ligasyon tahliliyle ilgili sınırlamalar, aynı zamanda, 5'-ucunun 3'-ucuna ek olarak, bir serbest hidroksile (veya bir fosfat grubuna) sahip olmasını gerektiren ikili ligasyon tahlili için de geçerlidir. Ayrıca T4 DNA ligazları, bir donör olarak RNA moleküllerinin ligasyonu ile uyumsuzdur (yani ligasyonun 5 'ucundaki RNA). Bu nedenle, ikinci nesil antisense 2'-O-metil RNA, 2'-O-metoksietil veya kilitli nükleik asitler içerenler, ikili ligasyon analizi ile uyumlu olmayabilir.

Nükleaz hibridizasyon deneyi

Nükleaz hibridizasyon deneyi

Nükleaz hibridizasyon deneyi,[7][8] olarak da adlandırılır S1 nükleaz kesme tahlili, bir nükleaz koruma deneyi bazlı hibridizasyon ELISA. Tahlil kullanıyor S1 nükleaz, tek sarmallı DNA ve RNA'yı oligo- veya mononükleotitlere indirgeyen, sağlam çift sarmallı DNA ve RNA bırakan.

Nükleaz hibridizasyon deneyinde, oligonükleotid analiti, tamamen tamamlayıcı bir kesme probu aracılığıyla 96 oyuklu bir plaka gibi katı destek üzerine yakalanır. S1 nükleaz ile enzimatik işlemden sonra, serbest kesme probu ve kesme probu metabolitlere hibritlenir, yani Analitin kısaltıcıları bozulur ve sinyalin yalnızca tam uzunlukta kesme probu-analit dubleksinden üretilmesine izin verilir.

Tahlil, çeşitli kimyalara karşı iyi toleranslıdır, örneğin bir nükleaz tahlilinin geliştirilmesi ile örneklendirilmiştir. morfolino oligonükleotidler.[9]

Bu tahlil kurulumu sağlamlıktan yoksun olabilir ve FDA'nın aşağıdaki yönergeleri izleyerek doğrulama için uygun değildir. biyoanalitik yöntem doğrulama. Bu, biyoanalitik yöntemler için FDA tarafından ana hatlarıyla belirtilen standartlara göre doğrulanmış yayınlanmış bir yöntemin yokluğu ile kanıtlanmıştır.

Referanslar

  1. ^ kim, Kalitsis, ji hun, paul; et al. "Nükleik Asitler: Hibridizasyon". Wiley. Alındı 4 Şubat 2017.
  2. ^ Efler, S.M .; Zhang, L .; Noll, B.O .; Uhlmann, E .; Davis, H.L. (2005), "İnsan plazmasındaki oligodeoksinükleotidlerin yeni bir hibridizasyon deneyi ile kantifikasyonu, kılcal jel elektroforezine göre büyük ölçüde artırılmış hassasiyet sunar", Oligonükleotidler, 15 (2): 119–131, doi:10.1089 / oli.2005.15.119, PMID  15989426
  3. ^ Deverre, Jean-Robert; Boutet, Valérie; Boquet, Didier; Ezan, Eric; Grassi, Jacques; Grognet, Jean-Marc (1997), "Fosfodiester ve fosforotioat antisens oligonükleotitlerinin plazma tespiti için rekabetçi bir enzim hibridizasyon deneyi", Nükleik Asit Araştırması, 25 (18): 3584–3589, doi:10.1093 / nar / 25.18.3584, PMC  146941, PMID  9278477
  4. ^ Deverre, Jean-Robert; Boutet, Valérie; Boquet, Didier; Ezan, Eric; Grassi, Jacques; Grognet, Jean-Marc (1997), "Fosfodiester ve fosforotioat antisens oligonükleotitlerinin plazma tespiti için rekabetçi bir enzim hibridizasyon deneyi", Nükleik Asit Araştırması, 25 (18): 3584–3589, doi:10.1093 / nar / 25.18.3584, PMC  146941, PMID  9278477
  5. ^ B1 ABD patenti 6355438 B1, Brenda F. Baker; Zhengrong Yu & Janet M. Leeds, "oligonükleotitleri ölçmek için yöntem", 2002-03-12'de yayınlanmış, Isis Pharmaceuticals, Inc'e verilmiştir. 
  6. ^ Tremblay, Guy A .; Khalafaghian, Garinée; Legault, Julie; Bartlett, Alan (Mart 2011), "Oligonükleotid terapötiklerinin spesifik belirlenmesi için çift ligasyon hibridizasyon deneyi", Biyoanaliz, 3 (5): 499–508, doi:10.4155 / biyo.11.18, PMID  21388263
  7. ^ ABD patenti 8163477, Zhengrong Yu; Brenda F. Baker & Hongjiang Wu, Isis Pharmaceuticals, Inc'e atanan, 2012-04-24'te yayınlanan "oligonükleotitleri tespit etmek ve ölçmek için nükleaz bazlı yöntem" 
  8. ^ Xiaohui, Wei; Dai, Guowei; Marcucci, Guido; Liu, Zhongfa; Hoyt, Dale; Blum, William; Chan, Kenneth K. (2006), "Plazma ve Hücresel Matrislerde Fosforotiyoat Oligonükleotitlerinin Belirlenmesi İçin Spesifik Bir Pikomolar Hibridizasyon Tabanlı ELISA Deneyi", Farmasötik Araştırma, 23 (6): 1251–1264, doi:10.1007 / s11095-006-0082-3, PMID  16718617
  9. ^ Burki, Umar; Keane, Jonathan; Blain, Alison; O'Donovan, Liz; Yürüyüş, Michael J .; Laval, Steven H .; Straub, Volker (2015), "Peptid-Konjuge Fosforodiamidat Morfolino Oligonükleotidlerinin Belirlenmesi için Ultrasensitive Hybridization Tabanlı ELISA Metodunun Geliştirilmesi ve Uygulanması", Nükleik Asit Terapötikleri, 25 (5): 275–284, doi:10.1089 / nat.2014.0528, PMC  4576940, PMID  26176274