Peptit-kütle parmak izi - Peptide-mass fingerprint

İçinde biyo-bilişim, bir peptid-kütle parmak izi veya peptit-kütle haritası bir kütle spektrumu karışımından peptidler sindirilmiş protein analiz ediliyor. Kütle spektrumu, proteini tanımlamaya hizmet edebilecek bir model olması anlamında bir parmak izi görevi görür.[1] 1993 yılında geliştirilen peptit-kütle parmak izi oluşturma yöntemi, bir proteinin izole edilmesinden, onu tek tek peptitlere ayrıştırılmasından ve bir tür kütle spektrometresi aracılığıyla peptitlerin kütlelerinin belirlenmesinden oluşur.[2] Bir kez oluşturulduktan sonra, bir peptit-kütle parmak izi, ilgili protein ve hatta genomik diziler için veri tabanlarında arama yapmak için kullanılabilir, bu da onu protein kodlayan genlerin açıklanması için güçlü bir araç haline getirir.[3]

Kitlesel parmak izi almanın en büyük avantajlarından biri, gerçekleştirmenin çok daha hızlı olmasıdır. peptid dizileme, yine de sonuçlar eşit derecede faydalıdır.[4] Dezavantajlar arasında, analiz için tek bir proteine ​​ihtiyaç duyulması ve protein dizisinin, en azından önemli bir homoloji ile bir veri tabanında yer alması gerekliliği bulunmaktadır. Tek tek peptitlerin kütlesi bir parmak izi oluştururken ölçüldüğünden, farklı protein karışımları güvenilmez sonuçlar verebilir. Bu nedenle numune hazırlama, süreçte önemli bir adımdır. O zaman bile, güvenilir sonuçlar elde edilirse, sonuçların yararlı olması için aradığınız veri tabanında eşleşen bir peptid dizisi bulunmalıdır.[5]

örnek hazırlama

SDS-PAGE jel elektroforezi

Kütle spektrometresi ile analiz etmeden önce, bir protein doğru bir şekilde izole edilmeli ve sindirilmelidir. İzole edilmemişse, sonuçlar iki veya daha fazla proteinin bir karışımını temsil edecek ve bu nedenle protein tanımlamasında güvenilmez olacaktır. Bu hassasiyet nedeniyle, numune hazırlama muhtemelen bir peptit-kütle parmak izi oluşturmanın en önemli adımıdır.

Spesifik bir proteinin izolasyonu genellikle bir form aracılığıyla yapılır. jel elektroforezi, burada proteinler boyuta göre ayrılır ve daha sonra daha fazla hazırlık için özütlenebilir. Bununla birlikte, aynı zamanda izole edilebilirler sıvı kromatografisi. Bu yöntem aynı zamanda proteinleri boyuta göre ayırır.[6]

Tek bir protein izole edildikten sonra, bir spektrometre ile daha fazla analiz için sindirilmesi ve parçalanması gerekir. Bu, proteolitik enzimlerin eklenmesi ile yapılır. tripsin ve kimotripsin.[7]

Hem izolasyon hem de sindirim adımlarını birleştiren yaygın olarak kullanılan başka bir yöntem, SDS-SAYFA proteinleri aynı anda ayıran ve parçalayan bir elektroforez formu.

Spektrometrik analiz

Sindirilmiş protein, aşağıdakiler gibi farklı kütle spektrometreleri ile analiz edilebilir. ESI-TOF veya MALDI-TOF. MALDI-TOF genellikle tercih edilen bir araçtır çünkü yüksek bir örnek verimi sağlar ve birkaç protein, aşağıdakiler ile tamamlanırsa tek bir deneyde analiz edilebilir. MS / MS analizi.[8]

Bir kütle spektrumu örneği

Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonunda (MALDI), parçalanmış bir peptit numunesi bir matrise yüklenir ve yüksek enerjili bir lazer kullanılarak iyonize edilir. Parçalanmış iyonlar daha sonra kütle-yük oranına göre ayrılır. Uçuş süresi (TOF) spektrometre aracılığıyla. Daha sonra parçalara ayrılabilir ve ardışık kütle spektrometrisinde, genellikle bir dört kutuplu iyon tuzağı,[9] aynı zamanda tandem uçuş süresi ile de mümkündür.[10]

Bir kütle spektrometresinden alınan çıktı, bir tepe listesi şeklinde gelir. Bu spektrum, numunede bulunan peptit parçalarının kütlelerini ve göreli bolluklarını gösterir. Gösterilen gibi bir spektrumu okurken, bir proteinin tüm olası ana fragmantasyonlarının dikkate alınması gerekir. Daha sonra bu parçaların kütleleri, spektrumun zirvelerindeki sayılarla ilişkilendirilir. Bir peptit-kütle parmak izi oluştururken kendi başına bir dereceye kadar analiz edilebilirken, tepe listesi, homolog peptit dizilerini bulmak için bir veri tabanı araştırmasından geçirilir.

Bilgisayar veritabanı analizi

Spektrometrik yollarla elde edilen tepe listesi, yazılımı kullanarak bir veritabanı aramasında sorgu olarak kullanılır. MASKOT.[11] MASCOT yazılımı, sonuçlara dayalı olarak numunedeki istatistiksel olarak en olası proteini sunmak için önemli peptit sekansı homolojisi arayan bir algoritma kullanır.

Aramayı gerçekleştirirken, daha çok içinden geçmek için bir veritabanı seçersiniz. Bu tür veritabanları arasında, diğerlerinin yanı sıra, insanlar, fareler ve mayalar gibi iyi karakterize edilmiş organizmaları araştırırken kullanılan Swissprot; ve daha genel, sağlam aramalar için NCBInr.

MASCOT yazılımını kullanmayla ilgili ayrıntılı bir eğitim aşağıdaki bağlantıda bulunabilir.

Başvurular

Peptit-kütle parmak izinin kullanımı, proteomik araştırmalarda oldukça yaygındır. Alanda nasıl kullanıldığına dair bazı özel örnekler aşağıdaki gibidir:

Psikotolerant mayalarda amilaz ve selülaz aktivitelerinin taranması ve karakterizasyonu

Bu çalışmanın yazarları, hangi mayaların daha düşük sıcaklıklarda metabolik olarak aktif olduğunu ve bu nedenle daha soğuk endüstriyel işlemler için kullanılabileceğini belirlemeye çalıştı. Ortamda, farklı sıcaklıklarda çeşitli mayalar yetiştirdiler, ardından bir jel üzerinde proteinleri ayırarak ve tek tek bantları parmak izleriyle belirleyerek enzim aktivitesini belirlediler. Veritabanı araştırması yoluyla, ilgilenilen enzimi buldular ve daha düşük sıcaklıklarda daha yüksek aktiviteye sahip iki ayrı maya keşfettiler.[12]

APOA-I: İlk Bölüm Şizofrenisinde Metabolik Yan Etkiler İçin Olası Yeni Bir Biyobelirteç

Bu çalışmanın yazarları şizofreni hastalarında risperidon ilacının metabolizması üzerindeki etkisini belirlemeye çalıştılar. Risperidonun negatif metabolik yan etkileri olduğunu keşfettikten sonra, MALDI-TOF ve parmak izi ile kontrol ve deney gruplarında glikoz ve lipid taşınması için membran proteinlerini test ettiler. Sonuçlar, değişmiş parmak izleri ve dolayısıyla proteinlerdeki katlanma seviyelerinin değiştiğini gösterdi. Böylece, risperidonun hastaların hücre zarlarında glikoz ve lipid taşıma proteinlerini olumsuz etkilediği sonucuna varmışlardır.[13]

Ayrıca bakınız

Referanslar

  1. ^ Biyolojik bilimlerde kütle spektrometresi
  2. ^ James, P .; Quadroni, M .; Carafoli, E .; Gonnet, G. (1993-08-31). "Kitle profili parmak izi ile protein tanımlama". Biyokimyasal ve Biyofiziksel Araştırma İletişimi. 195 (1): 58–64. doi:10.1006 / bbrc.1993.2009. ISSN  0006-291X. PMID  8363627.
  3. ^ Cottrell, J. S. (1994-06-01). "Peptit kitle parmak izi ile protein tanımlama". Peptid Araştırması. 7 (3): 115–124. ISSN  1040-5704. PMID  8081066.
  4. ^ Pappin, D. J .; Hojrup, P .; Bleasby, A. J. (1993-06-01). "Peptit-kütle parmak izi ile proteinlerin hızlı tanımlanması". Güncel Biyoloji. 3 (6): 327–332. doi:10.1016 / 0960-9822 (93) 90195-t. ISSN  0960-9822. PMID  15335725. S2CID  40203243.
  5. ^ Henzel, William J; Watanabe, Colin; Stults, John T (2003-09-01). "Protein tanımlama: peptit kitle parmak izinin kökenleri". Amerikan Kütle Spektrometresi Derneği Dergisi. 14 (9): 931–942. doi:10.1016 / S1044-0305 (03) 00214-9. PMID  12954162.
  6. ^ "EMBnet düğümü İsviçre" (PDF). www.ch.embnet.org. Alındı 2016-04-11.
  7. ^ Yates, J. R .; Speicher, S .; Griffin, P.R .; Hunkapiller, T. (1993-11-01). "Peptid kitle haritaları: protein tanımlamasına oldukça bilgilendirici bir yaklaşım". Analitik Biyokimya. 214 (2): 397–408. doi:10.1006 / abio.1993.1514. ISSN  0003-2697. PMID  8109726.
  8. ^ Yates, J.R. (1998-01-01). "Kütle spektrometrisi ve proteomun yaşı". Kütle Spektrometresi Dergisi. 33 (1): 1–19. doi:10.1002 / (SICI) 1096-9888 (199801) 33: 1 <1 :: AID-JMS624> 3.0.CO; 2-9. ISSN  1076-5174. PMID  9449829.
  9. ^ Ahmed, Farid E. (2008-12-01). "Proteom analizi için kütle spektrometrisinin faydası: bölüm I. Kavramsal ve deneysel yaklaşımlar". Proteomiklerin Uzman Değerlendirmesi. 5 (6): 841–864. doi:10.1586/14789450.5.6.841. ISSN  1744-8387. PMID  19086863. S2CID  38574652.
  10. ^ Vestal, Marvin L .; Campbell, Jennifer M. (2005-01-01). Tandem uçuş zamanı kütle spektrometresi. Enzimolojide Yöntemler. 402. s. 79–108. doi:10.1016 / S0076-6879 (05) 02003-3. ISBN  9780121828073. ISSN  0076-6879. PMID  16401507.
  11. ^ Wright, James C .; Collins, Mark O .; Yu, Lu; Käll, Lukas; Brosch, Markus; Choudhary, Jyoti S. (2012/08/01). "İyileştirilmiş bir Maskot Percolator kullanılarak elektron transfer ayrışmasıyla gelişmiş peptit tanımlaması". Moleküler ve Hücresel Proteomik. 11 (8): 478–491. doi:10.1074 / mcp.O111.014522. ISSN  1535-9484. PMC  3412976. PMID  22493177.
  12. ^ Carrasco, Mario; Villarreal, Pablo; Barahona, Salvador; Alcaíno, Jennifer; Cifuentes, Víctor; Baeza, Marcelo (2016-02-19). "Psikotolerant mayalarda amilaz ve selülaz aktivitelerinin taranması ve karakterizasyonu". BMC Mikrobiyoloji. 16: 21. doi:10.1186 / s12866-016-0640-8. ISSN  1471-2180. PMC  4759947. PMID  26895625.
  13. ^ Song, Xueqin; Li, Xue; Gao, Jinsong; Zhao, Jingping; Li, Youhui; Fan, Xiaoduo; Lv, Luxian (2014-04-07). "APOA-I: İlk Bölüm Şizofrenisinde Metabolik Yan Etkiler İçin Olası Bir Roman Biyobelirteç". PLOS ONE. 9 (4): e93902. doi:10.1371 / journal.pone.0093902. ISSN  1932-6203. PMC  3978061. PMID  24710015.

Dış bağlantılar