Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu - Recombinase polymerase amplification

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) tek tüplü, izotermal bir alternatiftir. polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR).[1] Ekleyerek ters transkriptaz tespit edebildiği bir RPA reaksiyonuna enzim RNA Hem de DNA ayrı bir aşamaya gerek kalmadan cDNA,.[2][3][4] Çünkü o izotermal, RPA, PCR'den çok daha basit ekipman kullanabilir; termal ısıl döngüleyici. En iyi 37–42 ° C sıcaklıklarda çalışmak ve oda sıcaklığında daha yavaş da olsa çalışmaya devam etmek, RPA reaksiyonlarının teorik olarak basitçe bir tüp tutarak hızlı bir şekilde yürütülebileceği anlamına gelir. Bu, RPA'yı düşük maliyetli, hızlı, bakım noktası moleküler testleri geliştirmek için mükemmel bir aday yapar. Moleküler tespitin uluslararası kalite değerlendirmesi Rift Vadisi ateş virüsü en iyi RT-PCR testlerinin yanı sıra, bazı PCR testleri tarafından kaçırılan daha az konsantre numuneleri tespit ederek ve RT-LAMBA Ölçek.[5]RPA, Cambridge, İngiltere merkezli bir biyoteknoloji şirketi olan TwistDx Ltd. (eski adıyla ASM Scientific Ltd) tarafından geliştirildi ve piyasaya sürüldü.

Teknik

RPA süreci üç çekirdek kullanır enzimler - bir rekombinaz, bir tek sarmallı DNA bağlayıcı protein (SSB) ve iplik değiştirme polimeraz. Rekombinazlar eşleşme yeteneğine sahiptir oligonükleotid dupleks DNA'da homolog sekansa sahip primerler.[1] SSB, yer değiştirmiş DNA ipliklerine bağlanır ve primerler yerinden edilmekten. Son olarak, iplikçik yer değiştiren polimeraz başlar DNA sentezi primerin hedef DNA'ya bağlandığı yer. PCR'ye çok benzeyen iki karşıt primeri kullanarak, hedef sekans gerçekten mevcutsa, üstel DNA amplifikasyonu reaksiyon başlatılır. Amplifikasyonu başlatmak için termal veya kimyasal eritme gibi başka hiçbir örnek manipülasyonuna gerek yoktur. Optimal sıcaklıklarda (37-42 ° C), reaksiyon hızla ilerler ve viral genomik DNA veya RNA'nın hızlı tespiti için tipik olarak 10 dakika içinde, sadece birkaç hedef kopyadan tespit edilebilir seviyelere spesifik DNA amplifikasyonu ile sonuçlanır,[2][3][4][6][7][8] patojenik bakteriyel genomik DNA,[9][10] yanı sıra kısa uzunluk aptamer DNA.[11]

Üç çekirdek RPA enzimi, ekstra işlevsellik sağlamak için başka enzimlerle desteklenebilir. Eklenmesi ekzonükleaz III gerçek zamanlı PCR'ye benzer şekilde gerçek zamanlı, floresans tespiti için bir exo probun kullanılmasına izin verir.[1] Eklenmesi endonükleaz IV, bir nfo probunun aşağıdakiler için kullanılabileceği anlamına gelir: yanal akış şeridi algılama başarılı amplifikasyon.[1][6][12] 37–42 ° C'de çalışan bir ters transkriptaz eklenirse, RNA ters transkripte edilebilir ve üretilen cDNA tek bir adımda amplifiye edilebilir. Şu anda RPA'nın sadece TwistAmp exo versiyonu ters transkriptaz dahil olarak mevcuttur, ancak kullanıcılar aynı etkiyi yaratmak için diğer TwistAmp reaksiyonlarını ters transkriptaz ile tamamlayabilir. PCR ile olduğu gibi, tüm RPA reaksiyonları çok katlı başka primer / prob çiftlerinin eklenmesi ile birden fazla analitin veya aynı tüpte bir dahili kontrolün saptanmasına izin verir.

Diğer amplifikasyon teknikleriyle ilişki

RPA, moleküler bir tanı tekniği olarak geliştirilecek birkaç izotermal nükleik asit amplifikasyon tekniğinden biridir ve sıklıkla, gerekli olan laboratuvar enstrümantasyonunu basitleştirmek amacıyla, PCR. Diğer izotermal amplifikasyon tekniklerinin kısmi bir listesi şunları içerir: LAMBA, NASBA, helikaza bağlı amplifikasyon (HDA) ve nicking enzim amplifikasyon reaksiyonu (YAKIN). Teknikler, primer tasarımı ve reaksiyon mekanizmasının özelliklerine göre farklılık gösterir ve bazı durumlarda (RPA gibi) iki veya daha fazla enzimin kokteyllerini kullanır. RPA gibi, bu tekniklerin çoğu basitleştirilmiş enstrümantasyon potansiyeli ile hızlı amplifikasyon süreleri sunar ve PCR'yi inhibe ettiği bilinen saflaştırılmamış örneklerdeki maddelere karşı direnç bildirmiştir. Amplifikasyon süresi ile ilgili olarak, hızlı sıcaklık rampalarına sahip modern termocycler, özellikle geleneksel üç sıcaklık protokolleri yerine çift sıcaklık döngüsü kullanan kısa amplikonlar için PCR amplifikasyon sürelerini 30 dakikadan daha aza indirebilir.[13] Ek olarak, numune hazırlama talepleri (gerekirse DNA veya RNA'nın parçalanması ve ekstraksiyonu dahil), tekniğin doğasında olan genel zamanın ve karmaşıklığın bir parçası olarak düşünülmelidir. Bu gereksinimler, tekniğin yanı sıra belirli hedef ve numune türüne göre değişir.

PCR ile karşılaştırıldığında, RPA için primer ve prob tasarımı için kılavuzlar daha az yerleşiktir ve belirli bir düzeyde deneme yanılma gerektirebilir, ancak son sonuçlar standart PCR primerlerinin de çalışabileceğini göstermektedir.[14] Bir (isteğe bağlı) dahili florojenik prob ile ileri ve geri bir primer ile sınırlanan ayrı bir amplikonun genel prensibi, PCR'ye benzer. PCR primerleri doğrudan RPA'da kullanılabilir ancak kısa uzunlukları, rekombinasyon oranlarının düşük olduğu ve RPA'nın özellikle hassas veya hızlı olmayacağı anlamına gelir. Etkili rekombinaz filaman oluşumu ve RPA performansı için tipik olarak 30-38 baz primer gereklidir. Bu, ek tasarım kısıtlamalarına tabi olarak daha fazla sayıda primer kullanan LAMP gibi diğer bazı tekniklerin tersidir. RPA'nın orijinal 2006 raporu fonksiyonel bir reaksiyon bileşenleri setini tanımlasa da, TwistAmp kitinin mevcut (tescilli) formülasyonu "büyük ölçüde farklıdır" [15] ve sadece TwistDx tedarikçisinden temin edilebilir. Bu, reaksiyon karışımları ile karşılaştırılmıştır. PCR birçok tedarikçiden temin edilebilen veya LAMBA veya NASBA bunun için reaksiyon karışımının bileşimi serbestçe yayınlanır ve araştırmacıların ucuz bileşenlerden kendi özelleştirilmiş "kitlerini" oluşturmalarına olanak tanır.

Yayınlanmış bilimsel literatür genellikle RPA, HDA ve LAMP gibi izotermal amplifikasyon tekniklerinin performanslarının birbirlerine göre ayrıntılı karşılaştırmasından yoksundur, çoğunlukla tek bir izotermal tekniği "altın standart" bir PCR tahliliyle karşılaştırır. Bu, imalatçıların, mucitlerin veya savunucuların iddialarından bağımsız olarak bu tekniklerin esasına karar vermeyi zorlaştırır. Ayrıca, herhangi bir amplifikasyon tekniğinin performans özelliklerinin primer tasarımından ayrıştırılması zordur: RPA için bir hedef için "iyi" bir primer seti, aynı hedef için "zayıf" bir LAMP primer setinden daha hızlı amplifikasyon veya daha hassas saptama sağlayabilir, ancak converse, farklı bir hedef için farklı primer setleri için doğru olabilir. Schmallenberg virüsü ve sığır viral diyare virüsünün tespiti için RT-qPCR, RT-LAMP ve RPA'yı karşılaştıran yakın tarihli bir çalışma bir istisnadır.[16] Bu, her amplifikasyon tekniğinin hedefe göre değişebilen güçlü ve zayıf yönlere sahip olduğunu ve mevcut amplifikasyon tekniklerinin özelliklerinin her uygulama için gereksinimlerle birlikte değerlendirilmesi gerektiğini etkili bir şekilde ortaya koymaktadır. PCR ve diğer herhangi bir amplifikasyon tekniğinde olduğu gibi, açık bir şekilde yayın yanlılığı vardır, kötü performans gösteren primer setleri nadiren raporlamaya değer kabul edilir.

Referanslar

  1. ^ a b c d Piepenburg, Olaf; Williams, Colin H .; Stemple, Derek L .; Armes, Niall A. (2006). "Rekombinasyon Proteinleri Kullanılarak DNA Tespiti". PLOS Biyoloji. 4 (7): e204. doi:10.1371 / journal.pbio.0040204. PMC  1475771. PMID  16756388.
  2. ^ a b Euler, Milena; Wang, Yongjie; Nentwich, Oliver; Piepenburg, Olaf; Hufert, Frank T .; Weidmann, Manfred (2012). "Rift Valley ateş virüsünün hızlı tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyon deneyi". Klinik Viroloji Dergisi. 54 (4): 308–12. doi:10.1016 / j.jcv.2012.05.006. PMID  22683006.
  3. ^ a b Amer, H.M .; Abd El Wahed, A .; Shalaby, M.A .; Almajhdi, F.N .; Hufert, F.T .; Weidmann, M. (2013). "Ters transkripsiyon rekombinaz polimeraz amplifikasyon deneyi kullanarak sığır koronavirüsünün teşhisi için yeni bir yaklaşım". Virolojik Yöntemler Dergisi. 193 (2): 337–40. doi:10.1016 / j.jviromet.2013.06.027. PMC  7113639. PMID  23811231.
  4. ^ a b Abd El Wahed, Ahmed; El-Deeb, Ayman; El-Tholoth, Mohamed; Abd El Kader, Hanaa; Ahmed, Abeer; Hassan Sayed; Hoffmann, Bernd; Haas, Bernd; Shalaby, Mohamed A .; Hufert, Frank T .; Weidmann, Manfred (2013). Meng, Xiang-Jin (ed.). "Ayak ve Ağız Hastalığı Virüsünün Hızlı Tespiti için Taşınabilir Bir Ters Transkripsiyon Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Testi". PLOS ONE. 8 (8): e71642. Bibcode:2013PLoSO ... 871642A. doi:10.1371 / journal.pone.0071642. PMC  3748043. PMID  23977101.
  5. ^ Escadafal, Camille; Paweska, Janusz T .; Grobbelaar, Antoinette; Le Roux, Chantel; Bouloy, Michèle; Patel, Pranav; Teichmann, Anette; Donoso-Mantke, Oliver; Niedrig, Matthias (2013). De Silva, Aravinda M (ed.). "Rift Valley Fever Virus Moleküler Tayininin Uluslararası Dış Kalite Değerlendirmesi". PLOS İhmal Edilen Tropikal Hastalıklar. 7 (5): e2244. doi:10.1371 / journal.pntd.0002244. PMC  3662703. PMID  23717706.
  6. ^ a b Boyle, D. S .; Lehman, D. A .; Lillis, L .; Peterson, D .; Singhal, M .; Armes, N .; Parker, M .; Piepenburg, O .; Overbaugh, J. (2013). "Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Erken Bebek Teşhisi için HIV-1 Proviral DNA'nın Hızlı Tespiti". mBio. 4 (2): e00135–13. doi:10.1128 / mBio.00135-13. PMC  3622927. PMID  23549916.
  7. ^ Euler, M .; Wang, Y .; Otto, P .; Tomaso, H .; Escudero, R .; Anda, P .; Hufert, F. T .; Weidmann, M. (2012). "Francisella tularensis'in Hızlı Tespiti için Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Testi". Klinik Mikrobiyoloji Dergisi. 50 (7): 2234–8. doi:10.1128 / JCM.06504-11. PMC  3405570. PMID  22518861.
  8. ^ Euler, M .; Wang, Y .; Heidenreich, D .; Patel, P .; Strohmeier, O .; Hakenberg, S .; Niedrig, M .; Hufert, F. T .; Weidmann, M. (2013). "Biyolojik Tehdit Ajanlarının Saptanması için Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Deneyleri Panelinin Geliştirilmesi". Klinik Mikrobiyoloji Dergisi. 51 (4): 1110–7. doi:10.1128 / JCM.02704-12. PMC  3666764. PMID  23345286.
  9. ^ Sebastian K, Valentina R, Frank FB, Markus von NR (2014). "Üç bakteriyel patojenin spesifik ve hızlı DNA tabanlı tespiti için multipleks izotermal katı faz rekombinaz polimeraz amplifikasyonu". Microchimica Açta. 181 (13–14): 1715–1723. doi:10.1007 / s00604-014-1198-5. PMC  4167443. PMID  25253912.
  10. ^ Santiago-Felipe S, Tortajada-Genaro LA, Morais S, Puchades R, Maquieira Á (2015). "Çift yönlü mikroorganizma tespiti için izotermal DNA amplifikasyon stratejileri". Gıda Kimyası. 174: 509–515. doi:10.1016 / j.foodchem.2014.11.080. hdl:10251/66087. PMID  25529713.
  11. ^ Loo JF, Lau PM, Ho HP, Kong SK (2013). "Sitokrom-c tespiti ve anti-kanser ilaç taraması için izotermal rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ile aptamer bazlı bir biyo-barkod analizi". Talanta. 115: 159–165. doi:10.1016 / j.talanta.2013.04.051. PMID  24054573.
  12. ^ Rohrman, Brittany A .; Richards-Kortum, Rebecca R. (2012). "HIV DNA'nın rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu gerçekleştirmek için kağıt ve plastik bir cihaz". Çip Üzerinde Laboratuar. 12 (17): 3082–8. doi:10.1039 / c2lc40423k. PMC  3569001. PMID  22733333.
  13. ^ "Hızlı PCR". Dna.utah.edu. Alındı 2014-06-21.
  14. ^ "PCR primerleri, standart RPA reaktifleri kullanarak çalışır". TwistDx. Alındı 2015-10-19.[kalıcı ölü bağlantı ]
  15. ^ "Yayınlar". TwistDx. Alındı 2014-06-21.
  16. ^ Aebischer Andrea (2014). "Schmallenberg Virüsü ve Sığır Viral İshal Virüsünün İzotermal Amplifikasyon Yöntemleri ve Yüksek Hızlı Gerçek Zamanlı Ters Transkriptaz PCR Kullanılarak Hızlı Genom Tespiti". Klinik Mikrobiyoloji Dergisi. 52 (6): 1883–92. doi:10.1128 / JCM.00167-14. PMC  4042763. PMID  24648561.