Surveyor nükleaz testi - Surveyor nuclease assay

Anketör nükleaz tahlil iş akışının şeması

Surveyor nükleaz testi tespit etmek için kullanılan bir enzim uyuşmazlığı klevaj testidir tek taban uyuşmazlıkları veya küçük eklemeler veya silmeler (Indels ).

Surveyor nükleazı, uyumsuzluğa özgü bir ailenin parçasıdır endonükleazlar kerevizde bulunanlar (CEL nükleazları).[1] Enzim, tüm baz ikamelerini ve eklemelerini / silmelerini tanır ve yüksek özgüllükle her iki DNA ipliğindeki uyumsuz sitelerin 3 ′ tarafını ayırır.[2]

Bu tahlil, çeşitli organizmalar ve hücre türlerindeki mutasyonları tanımlamak ve analiz etmek için ve ayrıca genom düzenlemesini takiben genom modifikasyonlarını doğrulamak için kullanılmıştır. CRISPR /TALEN'ler /çinko parmaklar ).

Arka fon

Bilinen ve bilinmeyen mutasyonları keşfetme ve tespit etme yeteneği, biyomedikal araştırma ve genetik tanıda büyük önem taşımaktadır (bkz. Uygulamalar). Bu nedenle, bu tür mutasyonların araştırmaya dayalı ve klinik tanısal tespitini sağlamak için çok sayıda yöntem geliştirilmiştir.

Dizi değişikliklerini / farklılıklarını tanımlamanın en doğrudan yolu, geleneksel ve yüksek verimli DNA sıralama yöntemleriyle DNA dizisini okumaktır (bkz. Sanger sıralaması ve DNA dizilimi ). Bununla birlikte, bu yöntemler büyük miktarlarda gereksiz veri sağlar ve kullanımları maliyetlidir.[3] Buna ek olarak, geleneksel sıralama germ hattı mutasyonlarının saptanması için yararlı olabilir, ancak düşük frekanslarda somatik minör alellerin saptanmasında daha az başarılı olabilir (mozaikçilik ). Bu nedenle, mutasyonu veya polimorfizmleri tespit etmek için dizilemeyen diğer yaklaşımlar gereklidir.

Yaygın olarak kullanılan diğer yöntemler, DNA'nın fiziksel özelliklerine bağlıdır, örneğin erime sıcaklığına dayalı sistemler Tek sarmallı konformasyonel polimorfizm analiz (SSCP) ve Denatüre edici yüksek performanslı sıvı kromatografisi (DHPLC). Bu teknikler genellikle kısa DNA fragmanlarının analizi (<1000 bp) ile sınırlıdır ve yalnızca polimorfizm (ler) in varlığını gösterebilir, ancak bir DNA dizisi içindeki bir mutasyonun yerini kolayca veremez. Bu nedenle, mutasyonu tam olarak tespit etmek veya aynı parçadaki birden fazla mutasyonu haritalamak için bu ek tekniklerle takip edilmelidir.[3]

Enzimatik uyumsuzluk klevaj tahlilleri, uyumsuzlukları saptamak ve ayırmak için uyumsuzluğa özgü endonükleazların özelliklerinden yararlanır. Bu yöntemler, standart laboratuar teknikleri ve ekipmanı kullanılarak çalıştırılması basittir ve polimorfizmleri, tek baz çifti uyumsuzluklarını ve düşük frekanslarda eklemeler ve silmeleri tespit edebilir.[4] Bu tür birkaç enzim keşfedilmiştir (CEL I, T4 endonükleaz VII, Endonükleaz V, T7 endonükleaz I dahil).[3]

Yaygın olarak kullanılan enzimlerden biri, her iki DNA zincirinin 3 ′ tarafını baz ikame veya ekleme / silme yerlerinde yüksek özgüllükle ayıran Surveyor nükleazdır (CEL II). Bu enzim, büyük DNA fragmanlarındaki çoklu mutasyonlarda yarılabilir ve bir popülasyondaki DNA'nın sadece küçük bir kısmını temsil eden uyumsuz DNA'dan saptanabilir yarılma ürünleri üretir, böylece enzim uyumsuz klevaj deneylerinde kullanım için uygun hale getirir.[2]

Tarih

1998'de Olekowski ve ark.[5] yeni bir uyumsuz spesifik endonükleaz tespit etti. Enzim kerevizden saflaştırıldı ve CEL I adı verildi.

CEL I'in, baz ikame uyumsuzluklarının 3 tarafında her iki iplikçikte yüksek özgüllükle DNA'yı kestiği ve bu nedenle mutasyonları ve polimorfizmleri tanımlamak için enzim mutasyonu saptama yöntemlerinde kullanılabileceği gösterilmiştir. Olekowski ve meslektaşları, insan BRCA1 genindeki çeşitli mutasyonları ve polimorfizmleri tespit etmek için bu enzimi kullanarak bu tekniği gösterdi.[1][5][6]

CEL'in saflaştırılmasını izlerken poliakrilamid jel elektroforezi, Yang vd.[1] tüm saflaştırma aşamaları sırasında bir arada kalan iki nükleaz bandı olduğunu fark etti. Ana nükleaz aktivitesi CEL I olarak adlandırılırken, SDS-PAGE üzerindeki küçük aktivite CEL II olarak adlandırıldı. CEL I ve CEL II'nin benzer olduğu ve her ikisinin de bir DNA uyumsuzluğunu parçalayabildiği sonucuna vardılar.

2004 yılında Qiu ve ark. Surveyor Nuclease olarak da bilinen CEL II'ye dayalı bir mutasyon tespit teknolojisi geliştirdi.[2] O zamandan beri bu yöntem, birçok farklı organizma ve hücre tipindeki mutasyonları ve polimorfizmleri tespit etmek için kullanılmıştır (uygulamalara bakınız).

Surveyor nukleazı, Fox Chase Kanser Merkezi tarafından Transgenomic, Inc. ve daha sonra satıldı IDT, şu anda dağıtır.

Surveyor nükleaz tahlil iş akışı

DNA Ekstraksiyonu

Başlangıçta ilgilenilen DNA (nükleer veya mitokondriyal DNA ) dokulardan veya hücre kültüründen ekstrakte edilir. Bu, Proteinaz K sindirimi ve ardından etanol çökeltmesi gibi standart özütleme yöntemleriyle veya ticari olarak temin edilebilen diğer yöntemlerle yapılabilir.

DNA'nın heterojen olduğu tahmin ediliyorsa, ör. farklı şekilde modifiye edilmiş hücre havuzundan veya heterozigot mutasyon taşıyıcılarından, kontrol DNA'sı eklemeye gerek yoktur.

Polimeraz zincirleme reaksiyonu

Hem mutant hem de vahşi tip referans DNA'daki ilgilenilen bölge, polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR). PCR reaksiyonu, nükleaz tarafından yorumlanacak PCR hatalarının ortaya çıkmasını önlemek için yüksek doğrulukta yeniden okuma polimeraz kullanılarak gerçekleştirilmelidir. PCR reaksiyonu, tek, güçlü bir PCR bandı oluşturmak için optimize edilmelidir çünkü spesifik olmayan bantlar, arkaplan gürültüsü tahlilin.

İlgili alelin, somatik olduğu gibi, düşük frekansta mevcut olması bekleniyorsa mozaikçilik veya heteroplazmik mitokondriyal DNA, vahşi tip ve mutasyon içeren DNA karışımından varyant alelleri zenginleştiren değiştirilmiş bir PCR protokolü düşünülebilir (ör. SOĞUK PCR ).

Hibrit DNA dupleks oluşumu

İlgili DNA, daha sonra Surveyor nükleaz tarafından tanımlanabilen mutasyon noktasında bir uyumsuzluk içeren heterodubleksler oluşturmak için denatüre edilir ve tavlanır. DNA'nın homojen olduğu tahmin ediliyorsa (örneğin, homoplazmik mitokondriyal DNA veya genomik DNA'nın her iki kromozomunda özdeş alleller), daha sonra nükleaz tarafından tanınabilen bir heterodubleks oluşturmak için bir kontrol numunesinden DNA gereklidir. DNA örneği heterojen ise, ek kontrol DNA'sına gerek yoktur; bununla birlikte, heterodubleksler oluşturmak için PCR ürünleri hala denatüre edilmeli ve tavlanmalıdır.

Sindirim

Tavlanmış DNA, heterodubleksleri ayırmak için Surveyor nükleaz ile işlenir. Tüm uyumsuzluk türleri, Surveyor nükleazı ile tanımlanabilir, ancak uyumsuzluk kesme tercihleri ​​en çok tercih edilenten en az tercih edilene dört gruba ayrılır: CT, AC ve CC, TT'ye göre eşit olarak tercih edilir, ardından AA ve GG izler ve son olarak bunu en az tercih edilen takip eder , AG ve GT. Sekans bağlamı ayrıca Surveyor nükleaz sindirim oranını da etkiler.[2]

Analiz

Sindirilmiş DNA ürünleri, geleneksel jel elektroforezi veya yüksek çözünürlüklü kapiler elektroforez kullanılarak analiz edilebilir. Bölünmüş ürünlerin tespiti, bir uyumsuzluğun oluşturduğu bir heterodubleksin varlığını gösterir. Mutasyon / polimorfizmin konumu, bölünmeden sonra fragman uzunluğu gözlemlenerek çıkarılabilir. PCR ürünlerinin 5 've 3' ucunu işaretlemek için floresan etiketli primerler kullanılırsa, analizde farklı renkli bantlar gözlemlenecektir. Her bandın boyutu bağımsız olarak mutasyon / polimorfizmin konumunu doğrular. Birden fazla mutasyon, birkaç parçanın varlığıyla tespit edilebilir.[1][5]

Avantajlar ve sınırlamalar

Avantajları

Uyumsuz nükleaz tahlillerinin avantajları

Uyumsuz nükleaz yöntemlerini kullanarak mutasyonları ve polimorfizmleri tespit etmenin ana avantajlarından biri, diğer yöntemlerin aksine, mutasyonun doğası hakkında önceden bilgi gerekmemesidir. kısıtlama parçası uzunluk polimorfizmleri Geçmişte SNP analizi için kullanılan (RFLP).

Erime sıcaklığına dayalı yöntemlerle karşılaştırıldığında, uyuşmazlığa özgü endonükleaz yöntemleri yalnızca daha hızlı olmakla kalmaz, aynı zamanda büyük DNA parçalarındaki çoklu mutasyonları da tespit edebilir.

Yöntemin, otomatik enjeksiyon kullanan yüksek verimli sistemlerde kullanılması uygun olup, tarama için uygun hale getirir.[7]

Sörveyör nükleazının avantajları

Surveyor nükleaz, popülasyonda sadece küçük bir DNA oranını temsil eden dizilerden saptanabilir bölünme ürünleri üreten, oldukça hassas bir enzimdir. Daha küçük PCR ürünleri (~ 0.6 kb) için 1:32 heterodubleksten homodublekse ve daha uzun PCR ürünleri (~ 2.3 kb) için 1:16 heterodubleksten homoduplekse oranını tespit edebilir. Bu özellik şunları mümkün kılar: havuz heterodubleks oluşumunu ve dolayısıyla duyarlılığı artırmak için klinik örnekler.[3] Bu aynı zamanda heterojen bir popülasyonda (heterojen tümör gibi) küçük varyantların saptanması için de yararlıdır. CRISPR veya diğer yöntemlerle genom düzenleme durumunda, bu özellik, bireysel düzenlenmiş klonların oluşturulması ve test edilmesinden önce bir hücre popülasyonundaki nadir düzenleme olaylarının tespitini geliştirebilir.

Surveyor nükleaz, bazıları diğerlerinden daha fazla tercih edilse bile, tüm uyumsuzluk türlerini ayırır: CT, AC ve CC, TT'ye göre eşit olarak tercih edilir, ardından AA ve GG ve son olarak, en az tercih edilen AG ve GT izler. Ayrıca algılar Indels en az 12 bp'ye kadar.[2]

Surveyor nükleaz testi, aynı parçadaki birden fazla mutasyonu da tespit edebilir. Bununla birlikte, bu, tahlilin arka planını da artırabilecek birkaç ek işleme adımı gerektirir (bkz. Sınırlamalar).

Sınırlamalar

PCR amplifikasyon ürünü

Bu testin ana sınırlamalarından biri, PCR amplifikasyonuna dayanması ve bu nedenle amplifiye ürünün kalitesinden etkilenmesidir. PCR artefaktları (örn. Primer dimerler veya kesilmiş ürünler) arka plan gürültüsünü artırabilir ve sinyali karartabilir. Primer-dimerleri ayrıca sörveyör nükleaz aktivitesini engelleyerek sinyali azaltabilir.

PCR yöntemi amplifikasyon sırasında kendi mutasyonlarını ortaya çıkarma potansiyeline sahip olduğundan, bu hatalar arka plan gürültüsünü de artırabilir. Bu nedenle, amplifikasyon hatalarını en aza indirmek için yüksek kaliteli bir polimeraz kullanmak en iyisidir.

Mitokondriyal DNA analizi, PCR reaksiyonu sırasında birlikte amplifiye edilen nükleer mitokondriyal DNA sekansları tarafından kontaminasyona duyarlı olabilir, bu da homoplazmik mitokondriyal DNA'ya karşı analizini karıştırır.[8]

Aynı fragmanda birden fazla mutasyonu tespit etmek için, PCR sonrası temizleme, Surveyor nükleaz sindiriminden önce yapılmalıdır. Birden fazla uyumsuzluğun tespiti, reaksiyonda zaman ve anketör nükleaz miktarını artırarak da geliştirilebilir, ancak bu aynı zamanda spesifik olmayan bölünme nedeniyle arka planı da artırır.

Anketör nükleaz enziminin sınırlamaları

Surveyor nükleaz ayrıca, uzatılmış inkübasyon sırasında arka plan sinyalini artıran çift sarmallı DNA'nın uçlarına saldıran 5 ′ eksonükleaz aktivitesine sahiptir.[2] Bu, sindirim süresini kısaltarak ve DNA polimeraz ekleyerek azaltılabilir.

Başvurular

CRISPR ve diğer yöntemleri kullanarak genom değişikliklerini onaylama

Son yıllarda bir dizi genom düzenleme teknolojisi ortaya çıkmıştır. çinko parmak nükleazları (ZFN'ler), transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler ) ve RNA kılavuzlu CRISPR / Cas9 nükleaz sistemi. Bu yöntemler, çift sarmallı bir DNA kırılması ve ardından homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) yollarıyla onarımı izleyerek genom düzenlemesini destekler. HDR'nin genom için tutarlı bir modifikasyon getirmesi beklenirken, NHEJ, Sanger dizilemesi kullanılarak tanımlanması zor olan heterojen bir mutasyon karışımı (genellikle küçük indeller) sağlayabilir. Nokta mutasyonları ve indelleri, anketör nükleaz analizi ile tespit edilebilir, bu da analizden önce klonal genişlemeye ihtiyaç duymadan bir hücre havuzunda genom düzenlemesini tespit etmeyi faydalı hale getirir ve ayrıca elde edilen hedefleme verimliliğinin bir tahminini sağlayabilir.[9][10][11] Klonal genişlemeden sonra bile, her alel farklı bir düzenleme olayına maruz kalabileceğinden, Sanger dizisi kullanılarak mutasyonların tespiti zor olabilir. Bu durumda, Surveyor nükleaz testi, bu etkiyi, uyumsuz endonükleaz tarafından tespit için gerekli heterodubleksleri oluşturmak için kullanacaktır.

İnsan genlerinde germ hattı mutasyonlarının tespiti

Surveyor nükleaz testi, germ hattı mutasyonları insan genlerinde. Örneğin, X'e bağlı zihinsel gerilik için ATRX,[12] ve β-talasemiye bağlı HBB geni.[7] Tahlil ayrıca solunum zinciri kusurlarıyla ilişkili mitokondriyal ve nükleer DNA mutasyonlarını tespit etmek için de kullanılmıştır.[13] ve böbrek hastalığıyla ilişkili mutasyonlar.[14][15]

Kanserde somatik mutasyonların tespiti

Surveyor nükleaz testi, somatik mutasyonlar çeşitliliğinde kanserle ilgili genler ve yukarıda belirtildiği gibi, örnek heterojen olduğunda ve mutant alel toplam allellerin yalnızca% 1-5'ini oluşturduğunda bile kullanılabilir.[16] Yöntem, aşağıdaki mutasyonları tespit etmek için kullanılmıştır. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR),[16][17][18][19] Janus Kinase 2 (JAK2),[20][21] s53 [22] ve diğerleri.

Diğer uygulamalar

Yöntem, ilaç direncine neden olan mutasyonları tespit etmek için kullanılmıştır. Tüberküloz.[23]

Referanslar

  1. ^ a b c d Yang, B .; Wen, X .; Kodali, N. S .; Oleykowski, C. A .; Miller, C. G .; Kulinski, J .; Besack, D .; Yeung, J. A .; Kowalski, D. (2000-04-04). "CEL I nükleazının saflaştırılması, klonlanması ve karakterizasyonu". Biyokimya. 39 (13): 3533–3541. doi:10.1021 / bi992376z. ISSN  0006-2960. PMID  10736152.
  2. ^ a b c d e f Qiu, Peter; Shandilya, Harini; D'Alessio, James M .; O'Connor, Kevin; Durocher, Jeffrey; Gerard, Gary F. (2004-04-01). "Surveyor nükleaz kullanarak mutasyon tespiti". BioTeknikler. 36 (4): 702–707. doi:10.2144 / 04364PF01. ISSN  0736-6205. PMID  15088388.
  3. ^ a b c d Yeung, Anthony T .; Hattangadi, Deepali; Blakesley, Lauryn; Nicolas Emmanuelle (2005-05-01). "Enzimatik mutasyon tespit teknolojileri". BioTeknikler. 38 (5): 749–758. doi:10.2144 / 05385rv01. ISSN  0736-6205. PMID  15948293.
  4. ^ Huang, Mo Chao; Cheong, Wai Chye; Lim, Li Shi; Li, Mo-Huang (2012-03-01). "Ampligaz aracılı T7 endonükleaz I ve mikroakışkan kapiler elektroforez ile Surveyor nükleaz kullanılarak basit, yüksek hassasiyetli bir mutasyon taraması". Elektroforez. 33 (5): 788–796. doi:10.1002 / elps.201100460. ISSN  1522-2683. PMID  22437793.
  5. ^ a b c Oleykowski, Catherine A .; Mullins, Colleen RB; Godwin, Andrew K; Yeung, Anthony T (1998). "Yeni bir bitki endonükleazı kullanarak mutasyon tespiti". Nükleik Asit Araştırması. 26 (20): 4597–4602. doi:10.1093 / nar / 26.20.4597. PMC  147896. PMID  9753726.
  6. ^ Kulinski, J .; Besack, D .; Oleykowski, C. A .; Godwin, A.K .; Yeung, A.T. (2000-07-01). "CEL I enzimatik mutasyon tespit testi". BioTeknikler. 29 (1): 44–46, 48. doi:10.2144 / 00291bm07. ISSN  0736-6205. PMID  10907074.
  7. ^ a b Hung, Chia-Cheng; Su, Yi-Ning; Lin, Chia-Yun; Chang, Yin-Fei; Chang, Chien-Hui; Cheng, Wen-Fang; Chen, Chi-An; Lee, Chien-Nan; Lin, Win-Li (2008/01/01). "HBB gen mutasyonlarının tanımlanması için uyumsuzluğa özgü endonükleaz yönteminin ve denatüre yüksek performanslı sıvı kromatografisinin karşılaştırılması". BMC Biyoteknoloji. 8: 62. doi:10.1186/1472-6750-8-62. ISSN  1472-6750. PMC  2525636. PMID  18694524.
  8. ^ Yen, Hsiu-Chuan; Li, Shiue-Li; Hsu, Wei-Chien; Tang, Petrus (2014/01/01). "Birlikte çoğaltılmış nükleer mitokondriyal DNA dizilerinin, SURVEYOR nükleaz ve WAVE HS sistemini kullanarak insan mtDNA heteroplazisinin belirlenmesine müdahalesi". PLOS ONE. 9 (3): e92817. Bibcode:2014PLoSO ... 992817Y. doi:10.1371 / journal.pone.0092817. ISSN  1932-6203. PMC  3963942. PMID  24664244.
  9. ^ Guschin, Dmitry Y .; Waite, Adam J .; Katibah, George E .; Miller, Jeffrey C .; Holmes, Michael C .; İnşaat Demiri, Edward J. (2010-01-01). "Endojen gen modifikasyonunu izlemek için hızlı ve genel bir deney". Moleküler Biyolojide Yöntemler. 649: 247–256. doi:10.1007/978-1-60761-753-2_15. ISBN  978-1-60761-752-5. ISSN  1940-6029. PMID  20680839.
  10. ^ Ran, F. Ann; Hsu, Patrick D .; Lin, Chie-Yu; Gootenberg, Jonathan S .; Konermann, Silvana; Trevino, Alexandro E .; Scott, David A .; Inoue, Azusa; Matoba, Shogo (2013-09-12). "Gelişmiş genom düzenleme özgüllüğü için RNA kılavuzlu CRISPR Cas9 ile çift nick". Hücre. 154 (6): 1380–1389. doi:10.1016 / j.cell.2013.08.021. ISSN  1097-4172. PMC  3856256. PMID  23992846.
  11. ^ Wang, Haoyi; Yang, Hui; Shivalila, Çikdu S .; Dawlaty, Meelad M .; Cheng, Albert W .; Zhang, Feng; Jaenisch, Rudolf (2013-05-09). "CRISPR / Cas aracılı genom mühendisliği ile çoklu gende mutasyonlar taşıyan farelerin tek aşamalı nesli". Hücre. 153 (4): 910–918. doi:10.1016 / j.cell.2013.04.025. ISSN  1097-4172. PMC  3969854. PMID  23643243.
  12. ^ Wada, Takahito; Fukushima, Yoshimitsu; Saitoh, Shinji (2006-07-15). "Bir uyuşmazlığa özgü endonükleaz kullanarak ATRX gen mutasyonları için yeni bir tespit yöntemi". American Journal of Medical Genetics Bölüm A. 140 (14): 1519–1523. doi:10.1002 / ajmg.a.31310. ISSN  1552-4825. PMID  16763962.
  13. ^ Bannwarth, Sylvie; Procaccio, Vincent; Paquis-Flucklinger, Veronique (2005-06-01). "Surveyor Nuclease: Solunum zinciri kusurları olan hastalarda heteroplazmik mitokondriyal DNA mutasyonlarının hızlı bir şekilde tanımlanması için yeni bir strateji". İnsan Mutasyonu. 25 (6): 575–582. doi:10.1002 / humu.20177. ISSN  1098-1004. PMID  15880407.
  14. ^ Tan, Ying-Cai; Blumenfeld, Jon D .; Anghel, Raluca; Donahue, Stephanie; Belenkaya, Rimma; Balina, Marina; Parker, Thomas; Levine, Daniel; Leonard, Debra G. B. (2009-02-01). "Otozomal dominant polikistik böbrek hastalığında PKD1 ve PKD2 mutasyonlarının genomik analizi için yeni yöntem". İnsan Mutasyonu. 30 (2): 264–273. doi:10.1002 / humu.20842. ISSN  1098-1004. PMID  18837007.
  15. ^ Voskarides, Konstantinos; Deltalar, Constantinos (2009-07-01). "Heterodubleks uyumsuzluklarda bölünme için SURVEYOR nükleaz kullanılarak böbrekle ilgili genlerdeki mutasyonların taranması". Moleküler Tanı Dergisi. 11 (4): 311–318. doi:10.2353 / jmoldx.2009.080144. ISSN  1943-7811. PMC  2710707. PMID  19525337.
  16. ^ a b Engelman, Jeffrey A .; Mukohara, Toru; Zejnullahu, Kreşnik; Lifshits, Eugene; Borrás, Ana M .; Gale, Christopher-Michael; Naumov, George N .; Yeap, Beow Y .; Jarrell, Emily (2006-10-01). "Alelik seyreltme, EGFR ile amplifiye edilmiş akciğer kanserinde biyolojik olarak önemli bir direnç mutasyonunun saptanmasını engeller". Klinik Araştırma Dergisi. 116 (10): 2695–2706. doi:10.1172 / JCI28656. ISSN  0021-9738. PMC  1570180. PMID  16906227.
  17. ^ Jackman, David M .; Holmes, Alison J .; Lindeman, Neal; Wen, Patrick Y .; Kesari, Santosh; Borras, Ana M .; Bailey, Christopher; de Jong, Francisca; Jänne, Pasi A. (2006-09-20). "Epidermal büyüme faktörü reseptör mutasyonu ve yüksek doz gefitinib ile tedavi edilen leptomeningeal metastazları olan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hastasında yanıt ve direnç". Klinik Onkoloji Dergisi. 24 (27): 4517–4520. doi:10.1200 / JCO.2006.06.6126. ISSN  1527-7755. PMID  16983123.
  18. ^ Jackman, David M .; Yeap, Beow Y .; Sequist, Lecia V .; Lindeman, Neal; Holmes, Alison J .; Joshi, Victoria A .; Bell, Daphne W .; Huberman, Mark S .; Halmos, Balazs (2006-07-01). "Epidermal büyüme faktörü reseptörünün Exon 19 delesyon mutasyonları, gefitinib veya erlotinib ile tedavi edilen küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hastalarında uzun süreli hayatta kalma ile ilişkilidir". Klinik Kanser Araştırmaları. 12 (13): 3908–3914. doi:10.1158 / 1078-0432.CCR-06-0462. ISSN  1078-0432. PMID  16818686.
  19. ^ Jänne, Pasi A .; Borras, Ana M .; Kuang, Yanan; Rogers, Andrew M .; Joshi, Victoria A .; Liyanage, Hema; Lindeman, Neal; Lee, Jeffrey C .; Halmos, Balazs (2006-02-01). "Epidermal büyüme faktörü reseptör mutasyonu taraması için hızlı ve hassas bir enzimatik yöntem". Klinik Kanser Araştırmaları. 12 (3 Pt 1): 751–758. doi:10.1158 / 1078-0432.CCR-05-2047. ISSN  1078-0432. PMID  16467085.
  20. ^ Jamieson, Catriona H. M .; Gotlib, Jason; Durocher, Jeffrey A .; Chao, Mark P .; Mariappan, M. Rajan; Lay, Marla; Jones, Carol; Zehnder, James L .; Lilleberg, Stan L. (2006-04-18). "JAK2 V617F mutasyonu, polisitemi veradaki hematopoietik kök hücrelerde meydana gelir ve eritroid farklılaşmasına yatkınlık oluşturur". Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri. 103 (16): 6224–6229. Bibcode:2006PNAS..103.6224J. doi:10.1073 / pnas.0601462103. ISSN  0027-8424. PMC  1434515. PMID  16603627.
  21. ^ Sattler, Martin; Walz, Christoph; Crowley, Brian J .; Lengfelder, Eva; Jänne, Pasi A .; Rogers, Andrew M .; Kuang, Yanan; Distel, Robert J .; Reiter, Andreas (2006-02-01). "Periferik kan örneklerinde Jak2'nin aktive edici mutasyonlarını tespit etmek için hassas, yüksek verimli bir yöntem". Kan. 107 (3): 1237–1238. doi:10.1182 / kan-2005-07-2899. ISSN  0006-4971. PMC  1895916. PMID  16434495.
  22. ^ Mitani, Noriaki; Niwa, Yoshimasa; Okamoto, Yasuyuki (2007-11-01). "Hematolojik malignitede p53 gen mutasyonlarının araştırmacı nükleaz bazlı tespiti". Klinik Biyokimya Yıllıkları. 44 (Pt 6): 557–559. doi:10.1258/000456307782268174. ISSN  0004-5632. PMID  17961311.
  23. ^ Shi, Ruiru; Otomo, Koji; Yamada, Hiroyuki; Tatsumi, Tayga; Sugawara, Isamu (2006-01-01). "HPLC, SURVEYOR nükleazı denatüre ederek Mycobacterium tuberculosis'in klinik izolatlarında ilaca dirençli gen mutasyonlarının tespiti için sıcaklık aracılı heterodubleks analiz". Mikroplar ve Enfeksiyon / Institut Pasteur. 8 (1): 128–135. doi:10.1016 / j.micinf.2005.06.008. ISSN  1286-4579. PMID  16182590.