Süspansiyon dizisi teknolojisi - Suspension array technology

Süspansiyon dizisi teknolojisi (veya OTURDU) yüksek verimli, büyük ölçekli ve çok katlı bir tarama platformudur. moleküler Biyoloji. SAT yaygın olarak uygulandı genomik ve proteomik araştırma gibi tek nükleotid polimorfizmi (SNP) genotipleme, Genetik hastalık tarama, gen ifadesi profilleme, tarama ilaç keşfi ve klinik tanı.[1][2][3] SAT, dizileri hazırlamak için mikro küre boncuklar (5,6 um çapında) kullanır. SAT, bu mikro küre boncuklarının kullanımıyla birden fazla gen varyantının eşzamanlı olarak test edilmesine izin verir, çünkü her bir mikro küre boncuk türü, optik özelliklerdeki varyasyonlara dayalı benzersiz bir tanımlamaya sahiptir, en yaygın olanı floresan renktir. Her renk ve rengin yoğunluğu benzersiz bir dalga boyuna sahip olduğundan, boncuklar dalga boyu yoğunluğuna göre kolayca ayırt edilebilir. Mikroküreler, çözelti içinde kolaylıkla askıya alınabilir ve bir tahlil sırasında uygun kinetik sergiler. Düz mikro dizilere benzer (ör. DNA mikrodizi ), DNA gibi uygun bir reseptör molekülü oligonükleotid problar antikorlar, veya diğeri proteinler kendilerini farklı şekilde etiketlenmiş mikrokürelere yapıştırın. Bu binlerce mikroküre dizi elemanı üretir. Prob-hedef hibridizasyonu genellikle, numunedeki her bir hedefin göreli bolluğunu belirleyen optik olarak etiketlenmiş hedefler tarafından tespit edilir.[4]

DNA hibridizasyonunu kullanarak SAT'a genel bakış

Model olarak DNA hibridizasyonunu kullanan süspansiyon dizisi teknolojisi prosedürlerine genel bakış.

DNA test parçaları oluşturmak için kullanılan hücrelerden çıkarılır. Bu test parçaları, çeşitli mikro küre boncukları içeren bir çözeltiye eklenir. Her mikro küre boncuk tipi, benzersiz bir DNA probu içerir. floresan Kimlik. Mikrokürecik boncuklar üzerindeki test parçaları ve probların birbirine hibridize olmasına izin verilir. Hibridize edildikten sonra, mikroküre boncuklar genellikle kullanılarak akış sitometrisi. Bu, orijinal örnekten her bir gen varyantının saptanmasına izin verir. Toplanan elde edilen veriler, her hibridize numunenin mikroküreye göre göreceli bolluğunu gösterecektir.

Çoğullama

Mikrokürecik boncuklar çözelti içinde kolayca süspanse edildiğinden ve her bir mikroküre, test numunesine hibritlendiğinde kimliğini koruduğundan, tipik bir süspansiyon dizisi deneyi, "çoğullama" adı verilen tek bir reaksiyonda geniş bir biyolojik analiz yelpazesini analiz edebilir. Genel olarak, bir dizide kullanılan her bir mikroküre türü ayrı ayrı toplu olarak hazırlanır. Örneğin, Luminex xMAP teknolojisinden ticari olarak temin edilebilen mikro küre dizileri, 10X10 eleman dizisi kullanır. Bu dizi, 100 elemanlı bir dizi vermek için her biri on farklı yoğunluğa sahip kırmızı ve kızılötesi boyalara sahip boncuklar içerir.[4] Bu nedenle, birden fazla boya kullanılırsa dizi boyutu katlanarak artacaktır. Örneğin, boya başına 10 farklı yoğunluğa sahip beş farklı boya, 100.000 farklı dizi elemanına yol açacaktır.

Prosedür

Örnek hedefleme

SAT, farklı tipte mikroküreleri kullanırken, aynı anda birden çok değişkeni test edebilir. DNA ve proteinler, belirli bir örnekte. Bu, SAT'ın tek bir reaksiyon sırasında çeşitli moleküler hedefleri analiz etmesini sağlar. Ortak nükleik asit tespit yöntemi, doğrudan DNA hibridizasyonunu içerir. Doğrudan DNA hibridizasyon yaklaşımı, mikrokürelere bağlanan 15 ila 20 bp DNA oligonükleotidlerinin kullanılarak amplifiye edildiği en basit süspansiyon dizisi deneyidir. PCR. Bu, prob-hedef hibridizasyonu sırasında farklı problar arasındaki erime sıcaklığı değişimini en aza indirdiği için optimize edilmiş prob uzunluğudur.[1] İlgili bir DNA oligoprobunu amplifiye ettikten sonra, her biri 100 potansiyel hedefi (eğer 100 pleks dizisi kullanılıyorsa) yakalama kapasitesine sahip 100 farklı mikro küre setinde 100 farklı prob oluşturmak için kullanılabilir. Benzer şekilde, hedef DNA örnekleri genellikle PCR güçlendirilmiş ve etiketlenmiş.[4] Yakalama probu ile hedef arasında hibridizasyon DNA eritme ve tavlama ile elde edilir tamamlayıcı hedef DNA mikrokürelerde bulunan yakalama problarına diziler. Sekanslar arasındaki spesifik olmayan bağlanmayı ortadan kaldırmak için yıkadıktan sonra, yalnızca güçlü şekilde çiftlenmiş prob-hedefler hibridize kalacaktır.[1]

Akış sitometrisi ile sıralama ve algılama

Bu konu hakkında daha fazla ayrıntı için bkz. akış sitometrisi

Her mikrokürenin optik kimliği bilindiğinden, mikrokürelere hibritlenen hedef numunelerin kantifikasyonu, bir mikroküredeki hedef markörlerin göreceli yoğunluğunun başka bir mikroküreler setindeki hedef markörlerle karşılaştırılmasıyla elde edilebilir. akış sitometrisi. Mikroküreler, hem benzersiz optik özellikleri hem de hedef diziye hibridizasyon düzeyi kullanılarak sınıflandırılabilir.

Güçlü

  • Hızlı / yüksek verim: Multipleks analizde, her 30 saniyede bir 100-plex tahlil analiz edilebilir. Yakın zamanda bildirilen yüksek iş hacmi akış sitometrisi 96 kuyucuklu bir plakayı 1 dakikada örnekleyebilir ve teorik olarak, bu sistemle 100 pleks test 1 saniyeden daha kısa sürede analiz edilebilir veya potansiyel olarak günde 12 milyon örnek verebilir.[4]
  • Yüksek dizi yoğunluğu / multipleks: Düz mikro dizilerle karşılaştırıldığında, SAT, bir kişinin paralel ölçümler yapmasına izin verir. Birkaç mikrolitre mikro küre, binlerce dizi öğesi içerebilir ve her bir dizi öğesi yüzlerce ayrı mikro küre ile temsil edilir. Böylece ölçüm akış sitometrisi her bir dizi elemanının kopya analizini temsil eder.[4]
  • Etkili bilgi toplama: SAT kullanmanın faydalarından biri, bir hastadan veya araştırma organizmasından bir örnek almanıza ve aynı anda birden fazla gen varyantını test etmenize izin vermesidir. Böylece, tek bir örnekten, bir hastanın bir dizi virüsten hangi virüse sahip olduğunu veya organizmada hangi baz çifti mutasyonunun benzersiz bir fenotip ile mevcut olduğunu belirleyebilirsiniz.[3]
  • Uygun maliyetli: Şu anda, ticari olarak temin edilebilen süspansiyon dizisi kitlerinin maliyeti, test edilen dizi başına 0,10-0,25 ABD dolarıdır.[1]

Zayıf yönler

  • Nispeten düşük dizi boyutu: Milyonlarca farklı dizi elemanı oluşturmak için artan miktarda boya kullanma potansiyeline sahip olmasına rağmen, piyasada bulunan mevcut mikro küre dizileri (Luminex xMAP teknolojisinden) yalnızca iki set boya kullanır ve bu nedenle, başına yalnızca ~ 100 hedef tespit edebilir. Deney.[4]
  • Farklı prob setleri ve hedef sekanslar arasındaki hibridizasyon, özel tavlama sıcaklığı, oligonükleotid probunun uzunluğu ve dizisinden etkilenir. Bu nedenle, her deney için yalnızca bir olası tavlama sıcaklığı kullanılabilir. Bu nedenle, belirli deneyde kullanılan tüm problar aynı sıcaklıkta hedefe hibridize olacak şekilde tasarlanmalıdır. Bazı prob setlerinde baz çifti uyuşmazlığının eklenmesi, her prob seti arasındaki tavlama sıcaklığı farklılıklarını en aza indirebilmesine rağmen, bir reaksiyonda 10-20'den fazla hedef test edilirse, hibridizasyon sorunu hala önemlidir.[1]

Referanslar

  1. ^ a b c d e Dunbar, Sherry A. (2006). "Hızlı, yüksek verimli çoğullamalı nükleik asit tespiti için Luminex xMAP teknolojisinin uygulamaları". Clinica Chimica Açta. 363 (1–2): 71–82. doi:10.1016 / j.cccn.2005.06.023. PMC  7124242. PMID  16102740.
  2. ^ Seideman, Jonathan; Peritt, David (2002). "Luminex-100 mikro küre sistemini kullanan yeni bir monoklonal antikor tarama yöntemi". İmmünolojik Yöntemler Dergisi. 267 (2): 165–171. doi:10.1016 / s0022-1759 (02) 00168-0. PMID  12165438.
  3. ^ a b Dunbar, Sherry A .; Vander Zee, Coe A .; Oliver, Kerry G .; Karem, Kevin L .; Jacobson, James W. (2003). "Bakteriyel patojenlerin kantitatif, çoğullamalı tespiti: Luminex LabMAP sisteminin DNA ve protein uygulamaları". Mikrobiyolojik Yöntemler Dergisi. 53 (2): 245–252. doi:10.1016 / S0167-7012 (03) 00028-9. PMID  12654495.
  4. ^ a b c d e f Nolan, John P .; Sklar Larry A. (2002). "Süspansiyon dizisi teknolojisi: düz dizi paradigmasının evrimi". Biyoteknolojideki Eğilimler. 20 (1): 9–12. doi:10.1016 / s0167-7799 (01) 01844-3. PMID  11742671.

Dış bağlantılar